Purifikace a hodnocení genomové DNA
Dostupnost jednoduchých metod purifikace DNA a RNA výrazně usnadnila analýzu a charakterizaci genomu a genové exprese. Existuje poptávka po rychlé a pohodlné izolaci DNA a RNA z různých buněčných zdrojů, včetně buněk a tkání savčích, rostlinných a bakteriálních kultur. Konvenční přístupy k izolaci a purifikaci DNA jsou založeny na vícestupňových postupech zahrnujících fenol/chloroform, aniontovou výměnu nebo výměnné systémy na silikagelu. Purifikace RNA obvykle zahrnuje chaotropní sůl a fenol/chloroform s dalším krokem purifikace oligo-dT, pokud je požadována mRNA.
Kvalita templátového materiálu, který je zahrnut do reakce PCR nebo RT, má zásadní vliv na spolehlivost výsledných údajů1. Je velmi důležité, aby byla stanovena a uvedena kvalita cílového materiálu2 a je žádoucí použít co nejkvalitnější nukleovou kyselinu. Tato kapitola obsahuje hloubkovou analýzu vlivu kvality cílového materiálu na výsledná data qPCR a RT-qPCR s přihlédnutím k čistotě i integritě.
Purifikace nukleové kyseliny
Purifikace nukleové kyseliny je prvním požadavkem pro většinu experimentů využívajících molekulární biologii. Vzorky DNA a RNA se často získávají prostřednictvím "surových" preparátů. Tyto purifikační metody mohou být rychlé a přímé a jsou užitečné zejména tehdy, když se vzorky používají při PCR/RT-PCR, kdy je požadováno pouze malé množství DNA nebo RNA. Některé aplikace vyžadují vzorek purifikovaný konvenčními metodami; konečná aplikace určí nejlepší metodu, kterou je třeba zvolit. Pokud je třeba, aby nukleová kyselina z biologického materiálu byla neporušená, čistá, koncentrovaná a bez inhibitorů navazujících enzymatických reakcí, vyžadují extrakční postupy přidání chaotrofických činidel.
Chaotropní činidla
Chaotropní činidlo je látka, která denaturuje proteiny, DNA nebo RNA narušením trojrozměrné struktury molekuly. Chaotropní látky narušují stabilizační vnitromolekulární interakce, které jsou zprostředkovány nekovalentními silami, jako jsou vodíkové vazby, van der Waalsovy síly a hydrofobní účinky. Mezi běžně používaná chaotropní činidla patří močovina (6-8 M), guanidin HCL (6 M) a chloristan lithný (4,5 M). Guanidin thiokyanát je silný denaturant proteinů, který je silnější než guanidin HCl a často se používá při izolaci neporušené ribonukleové kyseliny k eliminaci aktivity RNasy. Mnoho protokolů izolace RNA zahrnuje kromě chaotropu také přídavek merkaptoethanolu, aby se zajistilo redukční prostředí, které denaturuje čtyři disulfidové můstky vytvořené mezi osmi cysteinovými zbytky ribonukleázy A (RNázy A). Kombinace chaotropního činidla a redukčního činidla, jako je merkaptoethanol, způsobí, že se ribonukleáza rozloží a zcela ztratí svou aktivitu.
Extrakce genomové DNA
Příprava surové DNA
Přípravek Extract-N-Amp™. lze použít k rychlé a účinné extrakci genomové DNA (gDNA) připravené k PCR z téměř jakéhokoli typu vzorku pomocí jednoduchého protokolu s jednou zkumavkou, který trvá 15 minut nebo méně, v závislosti na vzorku. Soupravy Extract-N-Amp byly použity k extrakci gDNA ze vzorků, jako je plná krev, vlasové folikuly, myší ocásky, buňky tkáňových kultur, buňky bukálního stěru, Drosophila melanogaster, různé rostliny a semena. Na rozdíl od úplných purifikačních postupů se tento přístup vyhýbá mechanickému narušení, organické extrakci, purifikaci na kolonách nebo vysrážení DNA. Soupravy obsahují činidla pro extrakci a amplifikaci DNA, kterou lze použít v mnoha následných aplikacích, včetně analýzy PCR/qPCR.
Purifikace genomové DNA
DNA lze izolovat téměř z jakéhokoli buněčného nebo tkáňového zdroje. Purifikace gDNA vyžaduje její odstranění z buňky a zároveň ochranu před degradací. Izolační postupy musí být také dostatečně šetrné, aby chránily dlouhá vlákna DNA před mechanickým namáháním. Vzorek se nejprve odebere v pufru, jako je fosfátový pufr (PBS), který obvykle obsahuje detergent, jako je Triton™ X-100 nebo dodecylsulfát sodný (SDS), aby došlo k lyzi buněk a solubilizaci proteinů a lipidů. Proteináza K se přidává k oddělení shlukovaných buněk a tkání a k inaktivaci enzymů proteolytickým štěpením. Kyselina ethylendiamintetraoctová (EDTA) je chelátor, který v roztoku působí jako vychytávač iontů kovů a přidává se do pufrů pro čištění DNA k odstranění iontů hořčíku (Mg2+). Mg2+ je nezbytným kofaktorem pro DNázy, proto odstranění Mg2+ inaktivuje DNázy a zabraňuje degradaci DNA. RNáza je často součástí rozkladu RNA přítomné v buňkách.
Po lýze buněk a rozkladu RNA, proteinů a lipidů je třeba oddělit DNA od zbývajících zbytků těchto materiálů. Klasické purifikační metody používají fenol/chloroform3 k odstranění proteinů, přičemž DNA a další materiály rozpustné ve vodě zůstávají. TRI Reagent® používá úpravu této metody. Alternativně se používají systémy, jako jsou soupravy pro purifikaci gDNA GenElute™, kdy se DNA adsorbuje na membrány na bázi oxidu křemičitého (v jednosloupcovém a 96jamkovém formátu) za přítomnosti chaotropních solí, které narušují strukturu bílkovin. Při purifikaci DNA z rostlinného materiálu je třeba tkáň nejprve mechanicky narušit rozmělněním v tekutém dusíku, zatímco celá krev nebo bakterie se předem inkubují s enzymy, aby se zajistila účinná lýza buněk a uvolnění DNA. DNA se promyje, dokud je vázána na membrány, a poté se eluuje změnou koncentrace soli a následně se uvolní pomocí detergentu a chaotropního činidla. Proteiny, polysacharidy a zbytky buněk se odstraní srážecím postupem, po němž následuje odstředění přes filtrační kolonu.
Purifikace celkové RNA
Purifikace buněčné RNA je nutná pro studie genové exprese nebo jiných buněčných funkcí, které jsou regulovány RNA. Celková RNA je RNA přepsaná z buněčné DNA (gDNA a mitochondriální DNA, mtDNA) a obecně se vztahuje na vzorek obsahující: Nezahrnuje mikroRNA (miRNA) ani menší nekódující RNA (ncRNA). Celková RNA je zájmová frakce, která se izoluje pro analýzu genové exprese.
Izolace RNA je náročná kvůli všudypřítomnosti enzymů ribonukleáz (RNáz) v buňkách a tkáních, které rychle degradují RNA. Proto jsou do procesu purifikace zahrnuty inhibitory RNáz. Nejběžnější metodou purifikace je extrakce guanidinium-thiokyanát-fenol/chloroform. Na tomto principu je založen TRI Reagent®, což je monofázový roztok obsahující fenol a guanidin-tiokyanát. Vzorek tkáně nebo buňky se homogenizuje nebo naruší v TRI Reagentu, chloroform se smíchá s lyzátem a poté se směs rozdělí na tři fáze odstředěním. Vodná fáze obsahující RNA se odstraní a RNA se vysráží pomocí isopropanolu. Soupravy pro izolaci RNA GenElute zachycují RNA na křemičitou pryskyřici po lýze buněk. Soupravy GenElute používají guanidin thiokyanát a 2-merkaptoethanol k inaktivaci RNáz při izolaci celkové jaderné a cytoplazmatické RNA. V přítomnosti guanidin-thiokyanátu se bílkoviny snadno rozpouštějí, buněčné struktury se rozpadají a nukleoproteiny se oddělují od nukleových kyselin, protože se ztrácí sekundární struktura bílkovin. Kromě toho, protože guanidin thiokyanát je účinnější než guanidin HCL, RNasy jsou trvale denaturovány. Lyzáty se protáčejí filtrační kolonou, aby se odstranily buněčné zbytky a střižná DNA. Filtrát se poté nanese na vysokokapacitní křemíkovou kolonu, na kterou se naváže celková RNA, a následuje promytí a eluce vodou nebo pufrem bez RNáz.
Z celkového vzorku RNA tvoří většinu rRNA (~80 %), zatímco frakce mRNA pouze 2-5 %. U některých postupů může být žádoucí přečistit mRNA od výrazně hojnější rRNA a tRNA. Soupravy GenElute mRNA Kits poskytují vhodné postupy pro izolaci polyadenylované mRNA z předem připravené celkové RNA nebo přímo ze savčích buněk a tkání. Při přímé přípravě mRNA se buňky nebo tkáně rozruší pomocí SDS/proteinázy K, aby se uvolnila RNA a vyloučily RNázy. Oligo dT30 kovalentně navázané na polystyrenové kuličky o průměru 1 μm se poté použijí k zachycení polyadenylované mRNA hybridizací. Polystyrenové kuličky zůstávají během hybridizace suspendovány, čímž odpadá nutnost míchání nebo kývání. Komplexy mRNA a kuliček se promyjí na spinovém filtru mikrocentrifugy a poté se eluuje přečištěná mRNA.
Mnoho extrakčních metod používaných pro purifikaci "celkové RNA" specificky vybírá větší molekuly, a proto nejsou vhodné pro izolaci menších ncRNA, včetně miRNA. Existují speciálně navržené soupravy pro purifikaci frakcí menších druhů RNA, které mohou být vybrány v případě, že se jedná o templát zájmu.
Purifikace mikro RNA (miRNA) a nekódující RNA (ncRNA)
Purifikace miRNA a dalších, menších molekul ncRNA je náročnější vzhledem k jejich krátké délce. Je důležité zvolit vhodnou metodu izolace RNA, která zachovává malé RNA, a vyhnout se použití soupravy pro purifikaci celkové RNA, pokud výrobce výslovně neuvádí, že celková RNA zahrnuje malé RNA <100 bází. Extrakční metody pro ncRNA se zaměřují na rozdíly mezi molekulami RNA a jakýmikoli jinými kontaminujícími faktory, přičemž se používá specifická vazba na kolonu nebo srážení. RNAzol® je kyselá směs guanidin-tiokyanátu a fenolu, která narušuje buňky a tkáně a po přidání chloroformu nebo bromchlorpropanu odděluje všechny druhy RNA od proteinů a DNA. Purifikační metody pak umožňují oddělenou přípravu malých vzorků RNA, mRNA nebo celkové RNA, takže každou z těchto frakcí lze v následných aplikacích analyzovat paralelně. Soupravy pro izolaci mikroRNA miRPremier® jsou soupravy na bázi oxidu křemičitého s dvojnásobným vymytím, které jsou speciálně navrženy pro obnovu malé RNA. Souprava miRPremier používá metodu vysolování k odstranění větších molekul před navázáním malé RNA na kolonu, protože množství ethanolu potřebné k navázání malé RNA na oxid křemičitý (oxid křemičitý) vysráží také proteiny a další makromolekuly, čímž vznikne viskózní suspenze, která může ucpat kolony a zabránit účinnému obnovení RNA. Alternativním přístupem, jak tento problém obejít, je použití kroku předčištění k odstranění makromolekul, například extrakcí pomocí RNAzolu nebo předvázací kolony, aby bylo možné přidat dostatečné množství alkoholu k navázání malé RNA, aniž by došlo k ucpání kolony pro vazbu RNA.
Hodnocení kvality vzorků nukleových kyselin
Manipulace se vzorky a postupy extrakce nukleových kyselin jsou variabilní, proto je velmi důležité definovat spolehlivý protokol pro analýzu kvality a množství vzorků a zahrnout podrobnosti této analýzy do publikací2. Množství RNA je do značné míry určeno výtěžkem rRNA, zatímco kvalita RNA je dána čistotou (nepřítomností inhibitorů) a integritou molekul RNA. Při měření kvality vzorku však čistota a integrita ovlivňují výsledky; je obtížné určit čistotu a integritu vzorku o nízké koncentraci a přítomnost nečistot může rušit kvantifikaci. Existuje řada technik, které lze použít k posouzení množství a kvality nukleových kyselin, ale žádná z nich sama o sobě neposkytuje všechny informace potřebné k úplnému popisu vzorku. Proto je důležité zvážit soubor možností, aby bylo zajištěno, že kvalita vzorku neovlivní konečné údaje analýzy1.
Kvantifikace nukleových kyselin
UV spektroskopie
Nukleové kyseliny se tradičně kvantifikují měřením UV absorpce pomocí spektrofotometru. Absorbance zředěného vzorku DNA nebo RNA se odečítá při vlnové délce 260 nm a 280 nm. Optická hustota (OD) při 260 nm se používá ke stanovení koncentrace RNA nebo DNA v roztoku pomocí Beerova-Lambertova zákona, který předpovídá lineární korelaci mezi absorbancí a koncentrací.
Beer-Lambertův zákon
A = εbc
A = absorbance
b = délka dráhy kyvety v cm (obvykle 1 cm)
c = koncentrace analytu
ε = extinkční koeficient
Pro RNA je ε = 40 μg/ml
Pro DNA je ε = 50 μg/ml
Při OD při 260 nm (A260) je hodnota 1.0 odpovídá přibližně 40 μg/ml čisté RNA a 50 μg/ml čisté dvouřetězcové DNA. Beerův-Lambertův zákon však platí pouze pro hodnoty OD do 2 a uvedený vztah OD/koncentrace závisí na čistotě vzorků. Je zřejmé, že kontaminující látky s absorpcí při 260 nm nebo 280 nm ovlivní odhadovaný údaj OD. Čistá RNA má A260/A280 2,1, zatímco čistá DNA bude mít A260/A280 1,8.
| Očekávaná A260/A280<./sub> Poměr | |
|---|---|
| Dvouřetězcová DNA | 1.7-1,9 |
| RNA | 1.8-2.0 |
| Vliv pH na poměr | |
| DEPC voda (pH 5-6) | 1.6 |
| Voda bez nukleáz (pH 6-7) | 1.85 |
| TE (pH 8) | 2.14 |
| Vliv kontaminantů na poměr | |
| Kontaminace fenolem | ↓ poměru |
| Vysoká kontaminace bílkovinami | ↓ poměr |
| Kontaminace isothiokyanátem guanidinu | ↓ poměr |
Odstín potenciálně kontaminujících látek, jako jsou bílkoviny, chaotrofní soli a fenol, lze rovněž stanovit, pokud se absorbance vzorku měří při vlnové délce 280 nm a 230 nm (A280 a A230, ). Tímto způsobem lze poměr A260/A280 a A260/A230 použít jako ukazatel čistoty vzorku. Je však třeba poznamenat, že stanovení kontaminace DNA bílkovinami je při použití tohoto přístupu velmi necitlivé4.
Dodatečně narušuje odečet OD také pH a iontová síla pufru. Bylo prokázáno, že při použití různých zdrojů vody ke spektrofotometrickému stanovení existuje značná variabilita v poměru A260/A280 . Například změna pH vody v rozmezí pH 5,4 až 7,5-8,5 použité pro suspenzi RNA výrazně zvýšila poměr A260/A280 RNA přibližně z 1,5 na 2,05.
Důležité je, že jak poměr A260/A280 tak poměr A260/A230 se blíží hodnotě 2,0 (tabulka 7.1).
Kontaminace TRIS, etanolem a isopropanolem
Vliv kontaminace TRIS: Kontaminace TRIS nemá významný vliv na absorpční spektrum RNA/DNA.
Vliv kontaminace etanolem: Etanol nemá významný vliv na absorpční spektrum RNA/DNA při měření v TE o pH 8,0. Při měření v čisté vodě však může být poměr A260/A280 snížen, a tak poměr nižší než 2,0 může znamenat kontaminaci etanolem.
Vliv kontaminace isopropanolem: Isopropanol nemá významný vliv na absorpční spektrum RNA/DNA při měření v TE o pH 8,0. Vliv isopropanolu na absorpční spektrum RNA/DNA se projeví až při měření v TE o pH 8,0. Při měření v čisté vodě však může být poměr A260/A280 snížen, a tak poměr nižší než 2,0 může znamenat kontaminaci isopropanolem.
Kontaminace bílkovinami, guanidin-izothiokyanátem a fenolem
Vliv kontaminace bílkovinami: Vzorek obsahující kontaminaci 0.01 % BSA může vykazovat téměř normální absorpční spektrum, ačkoli poměr A260/A280 může klesnout pod 1,9 (RNA) nebo 1,7 (DNA), což je varování, že vzorek je něčím kontaminován. Při 0,5 % BSA se absorpční spektra jeví jako abnormální, což je jasná známka toho, že ve vzorku je značná úroveň kontaminace. Proto mohou být vysoké koncentrace bílkovin detekovány abnormálními poměry A260/A280 ale nízká a střední množství nikoli.
Vliv kontaminace izothiokyanátem guanidinu: Guanidin isothiokyanát má malý vliv na poměr A260/A280 proto má guanidin isothiokyanát malý vliv na kvantifikaci RNA. Přítomnost guanidin isothiokyanátu má však velmi silný vliv na poměr A260/A230 ; při 0,5% kontaminaci klesá poměr A260/A230 pod 0,5. V případě, že je guanidin isothiokyanát přítomen, je poměr A260/A230 velmi nízký. Vzorkům s podezřením na kontaminaci guanidinem je třeba se vyhnout, protože by to mělo škodlivý vliv na následné enzymatické reakce.
Vliv kontaminace fenolem: Fenol má velmi silný vliv na kvantifikaci RNA. Při 0,5% kontaminaci vzorku RNA fenolem v množství 50 ng/μl je naměřená koncentrace více než třikrát vyšší. Tento silný rušivý vliv fenolu na kvantifikaci RNA je způsoben kontaminujícím absorpčním píkem při vlnové délce 270 nm. Při velmi nízkých koncentracích RNA, pod 10 ng/μl, je tento kontaminující pík často zaměňován za RNA. Absorbance RNA je však vždy při 260 nm a nikdy ne při 270 nm, proto pokud je pík při 270 nm, je způsoben kontaminací. Po izolaci RNA metodou založenou na fenolu představuje chybné nadhodnocení koncentrace RNA závažný problém. To se týká zejména případů, kdy je koncentrace RNA nízká.
Automatická UV spektrofotometrie
Zatímco konvenční UV spektrofotometrie vyžadovala měření s použitím relativně velkých objemů vzorku, v současné době existují systémy, jako je NanoDrop® 2000 UV-Vis spektrofotometr, které jsou automatizované a podporují vysoce přesné analýzy extrémně malých vzorků. Systémy pro uchovávání vzorků eliminují potřebu kyvet a kapilár, což snižuje množství analyzovaného vzorku na 0,5 μl až 2 μl. NanoDrop poskytuje skenování absorbance od přibližně 200 nm do 350 nm, což je relevantní oblast pro stanovení koncentrace a čistoty RNA/DNA.
Systémy kvantifikace nukleových kyselin založené na fluorescenci
Použití fluorescenčních barviv ke kvantifikaci nukleových kyselin je alternativou k absorpční spektrofotometrii6,7. Stanovení koncentrace nukleových kyselin pomocí fluorescenčních metod využívá vazby malých molekul nebo barviv na nukleové kyseliny a měří následné změny fluorescenčních charakteristik. Ačkoli je kvantifikace založená na fluorescenci dražší než absorpční spektrofotometrie, je citlivější, přesnější a může být specifická pro danou nukleovou kyselinu.
Protože fluorometry měří fluorescenci spíše v relativních než absolutních jednotkách, měření se nejprve kalibruje pomocí známé koncentrace standardního roztoku nukleové kyseliny s vlastnostmi podobnými měřenému vzorku. Po kalibraci lze jediným měřením stanovit koncentraci nukleové kyseliny v roztoku, ale obvykle je zapotřebí standardní křivka, aby se zjistila linearita testu v měřeném rozsahu.
Automatické systémy, jako je fluorometr QuBit® 2.0 (Life Technologies), lze použít s řadou různých kvantifikačních testů založených na fluorescenci pro měření koncentrace nukleové kyseliny v roztoku. Tyto testy vykazují široký dynamický rozsah detekce a jsou schopny přesně analyzovat malé vzorky.
Je důležité si uvědomit, že údaj OD je mírou absorpce a nelze jej použít jako úplné hodnocení kvality vzorku. Stejně tak systémy založené na fluorescenci poskytují měřítko kvantity, nikoli kvality. Nelze je například použít jako test integrity vzorku a je třeba provést také vhodnou analýzu, například kapilární elektroforézu, rozlišení gelu nebo test poměru 3'/5' (jak je popsáno níže).
Gelová elektroforéza a kapilární systémy analýzy kvality nukleových kyselin
Gelová elektroforéza
RNA je sice termodynamicky stabilní, ale v přítomnosti téměř všudypřítomných enzymů RNáz se rychle rozkládá. V důsledku toho se ve vzorku běžně vyskytují kratší fragmenty RNA, které mohou potenciálně ohrozit výsledky následných aplikací. Proces degradace RNA je znám pouze částečně a závisí na typu přítomné RNázy. Také kvalita RNA z dané extrakce se může značně lišit a je třeba ji neustále sledovat. Proto je důležité určit integritu vzorků RNA.
Pro vyhodnocení možné degradace byly použity elektroforetické metody, které oddělují vzorky podle velikosti obsažených molekul. Historicky se integrita RNA hodnotila pomocí elektroforézy v agarózovém gelu obarveném ethidiumbromidem, který vytváří definovaný pásový vzor. Celková RNA na denaturačním agarózovém gelu vykazuje dva odlišné ribozomální fragmenty odpovídající buď 18S nebo 28S u eukaryotické RNA, nebo 16S a 23S u prokaryotické RNA a další fragmenty menších druhů RNA. Tradičně se intenzita těchto pásů rRNA na denaturačních agarosových gelech používala k výpočtu poměru, který sloužil jako ukazatel integrity RNA. RNA se považuje za vysoce kvalitní, pokud je poměr intenzity pásů eukaryotické 28S:18S přibližně 2,0.
Obrázek 1 ukazuje příklad hodnocení celkové RNA pomocí elektroforézy v agarózovém gelu barveném ethidium bromidem. U
kvalitní celkové RNA se dvě největší rRNA objevují jako diskrétní pásy o velikosti přibližně 5 kb a 2 kb a horní pás by měl mít přibližně dvojnásobnou intenzitu než spodní. MRNA se může jevit jako světlá šmouha nebo může být sotva patrná, většinou mezi oběma pásy rRNA.
Obrázek 1.Hodnocení integrity RNA pomocí analýzy v agarosovém gelu. Vzorky celkové RNA (2 μg) byly frakcionovány na 1% agarózovém gelu v pufru TBE a obarveny ethidiumbromidem. Dráhy 1 a 2 ukazují RNA vysoké kvality, zatímco dráhy 3 a 4 ukazují degradovanou RNA.
Gelová elektroforéza je však necitlivá metoda pro stanovení integrity vzorku a vyžaduje velké koncentrace vzorku. Při práci s malými vzorky je zřídkakdy k dispozici dostatečné množství pro provedení gelové elektroforézy a zároveň pro provedení všech požadovaných experimentů. Protože tento přístup závisí na lidské interpretaci snímků z gelu, je subjektivní, těžko srovnatelný mezi jednotlivými laboratořemi a výsledná data nelze digitálně zpracovat.
Některé z těchto problémů řeší analýza celkové RNA pomocí automatické kapilární elektroforézy.
Kapilární systémy pro analýzu kvality nukleových kyselin
Vzorky nukleových kyselin lze analyzovat a porovnávat pomocí přístrojů, jako je Agilent 2100 BioAnalyzer nebo Bio-Rad Experion. Pomocí těchto systémů se elektroforetické stopy používají k přiřazení číselných hodnot integrity nebo kategorií integrity.
Tyto přístroje využívají přístup laboratoře na čipu a kombinují kapilární elektroforézu s fluorescenční detekcí. Elektroforetický proces prováděný na čipu je založen na tradičních principech gelové elektroforézy, které byly miniaturizovány, což snižuje spotřebu vzorků a dobu separace.
Čip pojme jamky pro vzorky, gel a externí standard (žebříček velikosti fragmentů). Při výrobě jsou ve skle vyrobeny mikrokanálky, které vytvářejí propojené sítě mezi jamkami. Tyto mikrokanálky jsou pak vyplněny sítovým polymerem a fluorescenčním barvivem. Do jamek se vloží elektrody a z čipu se stane integrovaný elektrický obvod.
Nabité biomolekuly, jako je DNA nebo RNA, jsou hnány matricí v reakci na gradient napětí. Díky konstantnímu poměru hmotnosti a náboje a přítomnosti sítové polymerní matrice jsou molekuly odděleny podle velikosti tak, že menší fragmenty migrují rychleji než větší.
Molekuly barviva interkalují do vláken nukleových kyselin a tyto komplexy jsou detekovány laserem indukovanou fluorescencí. Data se pak převádějí na elektronické obrazy podobné gelu a elektroferogramy.
Bioanalyzátor Agilent 2100 se používá ve spojení se sadami RNA 6000 Nano a RNA 6000 Pico LabChip. Toto bioanalytické zařízení je založeno na kombinaci mikrofluidních čipů, napětím indukované separace velikosti v kanálech naplněných gelem a detekce laserem indukované fluorescence (LIF) v miniaturizovaném měřítku. Dvanáct vzorků lze zpracovávat postupně při spotřebě velmi malého množství každého vzorku. Molekuly RNA se barví interkalačním barvivem a detekují se pomocí LIF. Data jsou automaticky archivována a jsou k dispozici ve formě elektroferogramů, gelových obrázků a v tabulkovém formátu.
BioAnalyzer má dobrý lineární dynamický rozsah a test RNA 6000 Nano lze použít k analýze vzorků RNA o koncentracích od 25 ng/μl do 500 ng/μl. Ačkoli je spodní kvantitativní limit testu RNA 6000 Nano uveden jako 25 ng/μl, pro smysluplný výpočet čísla integrity RNA (RIN) se doporučuje použít alespoň 50 ng/μl. Při použití nižších koncentrací mohou být pozorovány vyšší odchylky RIN mezi jednotlivými vzorky. Test Pico lze použít ke stanovení integrity RNA pro vzorky o koncentracích v rozmezí 50 pg/μl až 5 ng/μl.
Software Agilent 2100 BioAnalyzer se používá k vyhodnocení podílu RNA zjištěného před, mezi a za píkem rRNA za účelem stanovení relativního čísla integrity (RIN) pro vzorek RNA. Intaktní RNA má RIN 10, zatímco zcela degradovaná RNA má RIN 1. Tímto způsobem je usnadněna interpretace elektroferogramu a je možné porovnávat vzorky.
Částečně degradovaná RNA (RIN <9) může při RT-qPCR poskytovat uspokojivé výsledky, ale je pravděpodobné, že to závisí na analyzovaných cílech, stupni požadované citlivosti a strategii RT. Strategie RT-qPCR, která používá dva kroky s oligo-dT k primární reverzní transkripci a primery PCR v blízkosti 5'-konce dlouhé cDNA, bude vyžadovat mnohem vyšší integritu vzorků než strategie, která používá jednostupňovou RT-qPCR s primery specifickými pro daný gen. Vliv různých strategií RT a jejich tolerance k degradovaným templátům je podrobně popsán (viz Reverzní transkripce). Kromě toho bude k detekci vzácného, nikoliv hojného cíle mRNA zapotřebí vyšší integrita vzorku. Proto by se měl také zvážit vliv degradace templátu na poměr cílů s různou hojností (např. testovacích a referenčních genů). Korelace mezi RIN a úspěšností RT-qPCR by měla být stanovena empiricky pro každou zkoušku. Ačkoli RIN nesmírně usnadňuje posouzení integrity přípravků RNA a výrazně usnadňuje porovnávání vzorků nebo postupů izolace RNA, není zatím možné předem určit, zda může být RNA pro daný experiment vhodná. Obrázek 2 ukazuje stopy Agilent BioAnalyzer pro dva vzorky RNA. Nebyl zjištěn žádný rozdíl ve výtěžnosti několika vzácných cílů mRNA v cDNA vytvořené pomocí jednostupňové RT-qPCR s použitím primerů specifických pro daný gen. Stejné cíle mRNA však byly detekovány až o 2 cykly později, což znamená 4krát méně mRNA, ve vzorku s nižší integritou (11, RIN = 7,0) než ve vzorku s vyšší kvalitou (9, RIN = 9,8) při použití dvoukrokové RT-qPCR s oligo-dT pro primer RT.
Obrázek 2Elektroferogram zobrazující hodnocení integrity RNA pomocí přístroje Agilent 2100 BioAnalyzer. Vzorky přípravků celkové RNA (~150 ng) byly frakcionovány na RNA 6000 Nanochip a rozlišeny pomocí Agilent 2100. Byla vyhodnocena integrita a přiřazen RIN
Kvalita vzorků je velmi důležitá, a proto musí být před jejich použitím v testech qPCR ověřena. Bylo jasně prokázáno, že analýza degradovaných vzorků RNA může vést ke špatné kvalitě dat1, ačkoli tomu tak není vždy8 a částečně závisí na protokolu RT (Reverzní transkripce)9.
Ačkoli jsou kapilární systémy velkým zlepšením oproti konvenční gelové elektroforéze, jedná se o specializovaná zařízení, která jsou drahá a nejsou přizpůsobena vysoké výkonnosti. Kromě toho bylo zjištěno, že RIN nemusí být všelékem, který by bylo žádoucí měřit. Obrázek 3 ukazuje vzorky, které byly podrobeny inkubaci na holé lidské kůži po dobu 1 minuty, přičemž při analýze celkové RNA pomocí přístroje Agilent BioAnalyzer neočekávaně nevykazovaly žádnou degradaci. Při použití alternativní metody pro stanovení degradace bylo zjištěno, že tyto vzorky obsahují degradované transkripty (viz níže).
Obrázek 3.Elektroferogram celkové RNA (~150 ng) rozlišené kapilární elektroforézou pomocí přístroje Agilent 2100 BioAnalyzer. RNA byla před analýzou inkubována na holé lidské ruce po dobu 1 minuty. Analýza RIN 10 naznačila, že RNA byla zjevně vysoce kvalitní a neporušená.
Z tohoto důvodu je důležité postupovat opatrně při interpretaci RIN a dalších automaticky generovaných měřítek integrity vzorku a zvážit další, pro transkript specifické šetření. Jeden takový přístup spočívá v měření cíle pomocí dvou nezávislých testů. Test integrity spočívá v měření poměru množství cíle umístěného směrem k 5' a k 3' téhož transkriptu (obrázek 4)10. To poskytuje relativní míru integrity RNA specifické pro transkript (protokol testu 3'/5' viz Příloha A).
Obrázek 4.Schéma znázorňující test integrity 3'/5'. cDNA se vyrábí z celkové RNA pomocí oligodT primed RT. Dva qPCR testy jsou navrženy tak, aby cílily na stejný transkript, a sondy jsou označeny různými fluorofory, aby se usnadnila multiplexní detekce. Pokud je RNA neporušená, detekce 5' a 3' testu by měla být stejná, zatímco pokud je RNA degradovaná, bude detekce 3' testu vyšší než 5' testu.
Takto se k hodnocení kvality vzorků RNA používá test poměru 3'/5'. Použití tohoto přístupu je demonstrováno na obrázku 5, a to testováním stavu transkriptu GAPDH (konkrétní zkoumané cíle by měly být testovány v každém daném experimentu) ve vzorku RNA, který byl zobrazen na obrázku 3. Po syntéze cDNA s oligo-dT primerem se transkript GAPDH kvantifikuje pomocí 5' a 3' testu. Pokud je RNA intaktní, očekává se stejná koncentrace při použití obou testů (poměr = 1), zatímco pokud je RNA degradovaná, očekává se vyšší počet kopií při 3' testu oproti 5' testu.
Obrázek 5. Demonstrace 3'/5' testu pro identifikaci vzorků degradované RNA. Přestože analýza přístrojem Agilent 2100 BioAnalyzer vrátila u obou těchto vzorků RNA hodnotu RIN 10, byla použita 3'/5' analýza, která prokázala 9 Cq (přibližně 1000násobný) úbytek v 5' analýze pro vzorek po 1minutové inkubaci na lidské ruce (1' degradace), zatímco 3' zůstala konstantní.
Analýza RNA pomocí přístroje Agilent 2100 BioAnalyzer vedla k závěru, že RNA zobrazená na obrázku 3 byla neporušená, přičemž byl zaznamenán RIN 10 jak pro RNA po 1' inkubaci na holé lidské ruce, tak pro stejný přečištěný vzorek před degradací. Při použití testu 3'/5' vykázal test 3' stejnou hodnotu Cq pro oba vzorky, zatímco test 5' vykazuje ztrátu 9 cyklů, což znamená 1000násobnou ztrátu 5' GAPDH a to, že transkript je degradován. Toto pozorování podporuje důkaz, že stav rRNA (významná složka algoritmu RIN) není spolehlivým ukazatelem integrity mRNA. Spolehlivost testu 3'/5' jako měřítka celkové kvality vzorku však závisí na rychlosti degradace jednotlivých transkriptů11. Za tímto účelem byla RNA extrahovaná z buněk HT29 podrobena degradaci inkubací po dobu 72 hodin při pokojové teplotě nebo alternativně po dobu 2 hodin při 62 °C. Kvalita všech vzorků byla analyzována pomocí přístroje Agilent 2100 BioAnalyzer. Testy byly rovněž navrženy pro 3' a 5' oblasti 13 všudypřítomně exprimovaných genů a množství těchto cílů bylo stanoveno v purifikovaném, vysoce kvalitním nedegradovaném vzorku RNA (HT29) pomocí obou testů pro každý gen (obrázek 6A).
Obrázek 6A.Stanovení kvality RNA pomocí testu 3'/5' a) Vzorky RNA z buněk HT29 s RIN přibližně 10 byly reverzně přepsány pomocí oligo-dT a pro každý ze 13 genů (osa X) byl stanoven poměr 3'/5' (osa y). Při použití obou testů pro stejný cíl a při vysoké kvalitě RNA dochází k obecnému zkreslení 3' kvantifikace. Míra zkreslení se u jednotlivých genů liší, což ovlivňuje stanovení poměrů mezi geny, například při normalizaci na referenční gen. (Data laskavě poskytl Prof. Stephen Bustin, UK.)
Obrázek 6B.Vzorky RNA z buněk HT29 s RIN přibližně 7 byly reverzně přepsány pomocí oligo-dT a pro každý ze 13 genů (osa X) byl stanoven poměr 3'/5' (osa y). Při použití obou testů pro stejný cíl a při vysoké kvalitě RNA a zřetelném 3' posunu oproti poměru demonstrovanému na obrázku 7.6A dochází k silnému 3' zkreslení kvantifikace. Stupeň posunu se u jednotlivých genů výrazně liší, což naznačuje, že různé geny degradují různou rychlostí. (Data laskavě poskytl Prof. Stephen Bustin, UK.)
Obrázek 6C.Vzorky RNA z buněk HT29 s RIN přibližně 5 byly reverzně přepsány pomocí oligo-dT a pro každý ze 13 genů (osa X) byl stanoven poměr 3'/5' (osa y). U replikátů je velký rozptyl údajů. (Data laskavě poskytl Prof. Stephen Bustin, UK.)
Při použití vysoce kvalitní RNA jsou data pro replikáty velmi blízká, ale je zřejmé, že u mnoha genů dochází k až desetinásobnému zkreslení testu, obvykle směrem k 3', přičemž u UBC je pozorováno dramatičtější stonásobné zkreslení. To může odrážet degradaci nebo rozdílnou detekci v testech v důsledku skládání templátu nebo jiného faktoru ovlivňujícího RT-PCR. U některých cílů se zdá, že jejich detekce je vychýlena k 5', což může být způsobeno rozdíly v účinnosti testu nebo jinými složkami testu RT-qPCR. Testy byly poté použity ke kvantifikaci stejných cílů pomocí cDNA z RNA s RIN 7,3 a 5,3 (obrázek 6B a 6C). Při použití vzorků RNA se střední degradací (RIN 7) byly patrné jasné známky degradace, přičemž většina genů vykazovala 3' posun mezi 10 a 1 000násobkem, což naznačuje degradaci těchto transkriptů mezi 3' a 5' testy. Zajímavé je, že tři geny vykázaly 5' posun, což může naznačovat, že degradace vedla ke změně konformace, která činí RT nebo 5' qPCR účinnější. Jelikož jsou změny u každého genu jiné, je zřejmé, že poměr mezi geny měřený pomocí RIN 9 RNA by se výrazně lišil od poměru měřeného pomocí RIN 7 RNA. Při použití RNA s RIN 5 je vyšší míra variability a poměr 3'/5' pro každý gen se pohybuje v průměru kolem 1. Vzhledem k tomu, že průměr 3'/5' =1 by se očekával i od vysoce kvalitní intaktní RNA, uznává se, že tento systém je použitelný pro stanovení integrity vzorků RNA se střední až zřejmě žádnou degradací a je zlepšením při použití jako doplněk ke gelové nebo kapilární elektroforéze.
Zajímavé bylo pozorování 5' bias v testech. Teoreticky by u testů se stejnou účinností nemělo být možné vytvořit více 5' než 3' amplikonu. Je zřejmé, že rozdílnou účinnost těchto testů ovlivňují další faktory. Dalším aspektem kvality vzorku je přítomnost kontaminantů, které mohou inhibovat nebo dokonce zvyšovat výkon RT nebo qPCR, a zda mohou být specifické pro daný genarcel.
Kontaminace
Podrobnější informace naleznete v tabulce.V kontextu testů PCR jsou významnými formami kontaminace templát nukleové kyseliny, který je ve vzorku nevhodně přítomen, což může být detekováno také spolu se specifickým cílem a vést k falešně pozitivním výsledkům, nebo materiál, který může inhibovat navazující reakce, což způsobuje falešně negativní výsledky nebo nižší odhady koncentrace templátu.
Kontaminace šablony
PCR testy jsou obzvláště náchylné ke kontaminaci amplikonu specifickou cílovou sekvencí zájmu, protože proces PCR exponenciálně generuje kopie amplikonu. V důsledku toho proces provádění testu PCR vytváří dokonalý kontaminant pro budoucí testy PCR. V laboratoři molekulární biologie je nezbytné oddělit prostor, ve kterém se reakce nastavuje a probíhá, od prostoru pro analýzu po PCR, kde se bude produkt PCR analyzovat a dále s ním manipulovat. Pokud je to možné, je vhodnější používat oddělené místnosti s vyhrazeným vybavením a laboratorními plášti tak, aby nic z prostoru pro post-PCR analýzu nepřišlo do styku s čistým prostorem (před-PCR). Mnoho laboratoří také zavádí další kontroly přístupu personálu do těchto prostor, aby se zabránilo přenosu reakcí. Kvantitativní analýzy PCR jsou obzvláště náchylné ke kontaminaci amplikonu, protože jsou schopny detekovat jedinou molekulu templátu a kontaminující templát zmate měření množství.
Kromě generování specifického amplikonu PCR je třeba v laboratorním uspořádání dbát na to, aby se původní templátový materiál nepřenášel z jednoho vzorku na druhý (křížová kontaminace) nebo, v případě analýzy lidských vzorků, aby se materiál nedostal od personálu provádějícího analýzu.
Důrazně se doporučuje zavést standardní experimentální postup s vhodnými kontrolami pro identifikaci potenciálních zdrojů kontaminace.
Kontaminace RNA gDNA
Při analýze RNA je důležité zajistit, aby nedošlo ke kontaminaci gDNA. Enzymatické ošetření vzorků roztokem DNázy I se doporučuje pro odstranění kontaminující gDNA a je zvláště důležité pro vyšetřování genů bez intronů nebo v případech, kdy návrh testu nerozlišuje mezi sekvencemi gDNA a cDNA. Pokud je to možné, doporučuje se navrhovat testy přes hranici intron/exon tak, aby bylo možné amplifikovat a/nebo detekovat pouze zpracované sekvence mRNA. To nemusí vždy zabránit amplifikaci z gDNA, protože existují sekvence, které existují jako zpracované pseudogeny, které jsou ve skutečnosti genomickými sekvencemi cDNA (viz PCR/qPCR/dPCR Assay Design). Je také třeba vzít v úvahu, že DNA existuje v činidlech a potenciálně může způsobit problémy s kontaminací12.
.Inhibice
Přítomnost inhibitorů rozdílně ovlivňuje testy qPCR na různé cíle13. Přítomnost inhibitorů ve vzorku proto může vést ke komplexnímu narušení skutečných dat. Jelikož je každý test ovlivněn jinak, výsledné poměry mezi množstvím genu zájmu (GOI) a referenčního genu nemusí odrážet skutečné množství každého genu, což vede k nesprávným odhadům relativních cílových množství nebo k obtížím při interpretaci genotypových testů.
InhibitoryPCR, které se běžně zavádějí během experimentálních procesů, zahrnují: tris, ethanol, isopropanol, EDTA, enzym reverzní transkriptázu, guanidin isothiokyanát a fenol.
Jedním ze systémů, který lze použít k detekci inhibitorů, je test SPUD14 (obrázek 7). Při použití této metody se umělý amplikon (odvozený ze sekvence nukleové kyseliny bramboru, která nemá homologii s žádnou jinou známou sekvencí) podrobí qPCR v přítomnosti vody (kontrola amplifikace; obrázek 7 vzorek a) nebo testovaného vzorku (obrázek 7 vzorky b a c). Pokud testovaný vzorek neobsahuje inhibitor testu SPUD, bude kvantifikační cyklus (Cq) zaznamenaný pro kontrolu amplifikace a testovaný vzorek stejný. Pokud však testovaný vzorek obsahuje inhibitor, Cq se zvýší (podrobný protokol testu je uveden jako SPUD protokol, Příloha A).
Obrázek 7.7.Zastoupení testu SPUD. V tomto případě ukazuje rozdíl v Cq mezi vzorkem c a kontrolním vzorkem a přítomnost inhibitoru.
Integrovaný příklad: Každá z dříve popsaných metod kontroly kvality vzorku se používá k určení specifické vlastnosti vzorku. Tato část obsahuje popis příkladu pracovního postupu, který lze použít na vzorky, s popisem údajů, které poskytuje každá zkouška kontroly kvality. Předložené šetření není vyčerpávající ani není poskytováno jako definitivní standardní pracovní postup; je uvedeno pouze jako příklad možného postupu kontroly kvality.
Připraveno bylo pět vzorků RNA, které jsou označeny postupně A až E. Ty byly analyzovány pomocí přístroje NanoDrop a bylo zjištěno, že mají velmi podobnou koncentraci (přibližně 100 ng/μl). Poměr A260/A280 byl zaznamenán dvakrát pomocí dvou nezávislých měření pro každý vzorek (obrázek 8) a bylo zjištěno, že je přibližně 1.9 ve všech případech, což naznačuje vzorky vysoké kvality a bez kontaminantů, které by byly zjištěny při A280 nm, přičemž je pozoruhodné, že v této analýze chybí odečet A230 nm. Analýza pomocí kapilární elektroforézy (přístroj Agilent 2100 BioAnalyzer) ukazuje jiný obraz (obrázek 9). Vzorky A a B jsou vysoce kvalitní (RIN 10 a koncentrace 110 ng/μl ve shodě s odečtem NanoDrop), vzorek C je vysoce degradovaný (RIN 2,4, koncentrace 62 ng/μl je poloviční oproti stanovení koncentrace NanoDrop) a vzorky D a E jsou vysoce kvalitní (RIN 9,1 a 9,5), ale s nižší koncentrací než vzorky A a B (30 ng/μl a 43 ng/μl). Informace z obou metod měření se do jisté míry doplňují, protože NanoDrop neodhalí degradaci. Jsou však také v rozporu, protože koncentrace vzorků D a E se výrazně liší. To by mohlo být důvodem k obavám a mělo by to být podnětem k dalšímu zkoumání. Kapilární elektroforéza je sice mocným nástrojem pro hodnocení vzorků, ale má relativně nízkou kapacitu a není dostupná všem výzkumníkům. Alternativním testem integrity vzorku je analýza 3'/5'. Tato zkouška byla použita na vzorky A-E s použitím stejných koncentrací podle odečtu NanoDrop. Při testování těchto vzorků pomocí tohoto přístupu bylo zřejmé, že RNA vzorků A (obrázek 10A) a B (údaje nejsou uvedeny, identické se vzorkem A) byla neporušená, zatímco u vzorku C byla vysoce degradovaná (obrázek 10B). Všimněte si, že u vzorku C se hodnota Cq pro 5' i 3' test výrazně posunula k vyšším hodnotám, což dokazuje ztrátu specifického cíle ve srovnání se vzorky A a B. Profil pro vzorky D a E nebyl v souladu s očekáváním (obrázek 10C ukazuje vzorek D, údaje pro vzorek E nejsou zobrazeny, ale byly podobné), protože 5' testu je nižší Cq než 3', což naznačuje více 5' signálu než 3' ve vzorku cDNA vyrobeném z oligo-dT primingu. Alternativním vysvětlením je, že tyto vzorky obsahují inhibitor, který ovlivňuje 3' test více než 5'. Pro ověření této teorie byl na všech vzorcích proveden test SPUD (obrázek 11). Ve vzorcích A až C není žádný důkaz o přítomnosti inhibitoru, ale vzorky D i E vykazují inhibici testu SPUD, přičemž vzorek D způsobuje úplné selhání testu.
Využitím všech informací lze dojít k závěru, že v každém vzorku byla stejná koncentrace materiálu nukleové kyseliny (NanoDrop) a vzorky obsahovaly nedetekovatelné kontaminanty, které absorbují při vlnové délce 280 nm (protein) (jiné vlnové délky nebyly testovány). Vzorky A a B měly vysokou integritu bez zjištěných inhibitorů, vzorek C byl vysoce degradovaný (kapilární elektroforéza a 3'/5' test) bez zjištěných inhibitorů a vzorky D a E byly neporušené, ale obsahovaly inhibitory PCR (3'/5' a SPUD).
Obrázek 8.Hodnocení kvality NanoDrop (A260/A280).
Obrázek 9.Analýza vzorků RNA na bioanalyzátoru Agilent 2100 A-E.
Obrázek 10A.GAPDH 3'/5' multiplexní test RNA Vzorek.
Obrázek 10B.GAPDH 3'/5' multiplexní test Vzorek C.
Obrázek 10C.GAPDH 3'/5' multiplexní test Vzorek D.
Obrázek 11.Analýza SPUD vzorků A-E.
Network error: Failed to fetch
Odkazy
Abyste mohli pokračovat ve čtení, přihlaste se nebo vytvořte účet.
Nemáte účet?Toto je strojově přeložená stránka.
