Kontrola kvality oligonukleotidů pomocí analytické HPLC

RP-HPLC (vysokoúčinná kapalinová chromatografie s reverzní fází), IE-HPLC (vysokoúčinná kapalinová chromatografie s iontovou výměnou) a UPLC (ultraúčinná kapalinová chromatografie) umožňují kvantitativní hodnocení čistoty oligonukleotidů. Tato hodnocení jsou k dispozici na vyžádání za příplatek. 

RP-HPLC

RP-HPLC je založena na rozdílu v hydrofobitě mezi sekvencí plné délky (má hydrofobní tritylovou skupinu) a krátkými sekvencemi (nemají tritylovou skupinu). Zatímco sekvence plné délky je na koloně zachycena, shortmery jsou vymyty
(obrázek 1). Rozlišení je vynikající pro analýzu až 50 bází, i když v některých případech může být roztaženo až na 80 bází. RP-HPLC je výkonná technika pro separaci široké škály molekul.

Obrázek 1. A. Separace pomocí RP-HPLC B. Příklad chromatogramu na reverzní fázi.

IE-HPLC

IE-HPLC je založena na počtu nabitých skupin (fosfátů) v oligonukleotidové páteři. Metoda aniontové výměny zahrnuje použití mobilní fáze s gradientem solí na kvartérní amoniové stacionární fázi (obrázek 2). Rozlišení je vynikající pro analýzu až 40 bází. Hlavním důvodem pro použití IE-HPLC na rozdíl od RP-HPLC je analýza oligonukleotidů s významnou sekundární strukturou, které se obvykle vyskytují v sekvencích s vysokým obsahem GC. IE-HPLC je pro takové oligonukleotidy účinná, protože mobilní fáze má vysoce alkalické pH, které narušuje vodíkové vazby, a tedy i sekundární strukturu.

Obrázek 2. A. Separace pomocí IE-HPLC B. Příklad aniontově výměnného chromatogramu.

UPLC

Díky pokroku ve výkonnosti částicové chemie, detektorů a systémů se standardní HPLC změnila v ultra výkonné přístroje. UPLC umožňuje účinnou separaci analytů; v tomto případě krátkých a dlouhých oligonukleotidů s rozlišením jedné báze. Účinnost přístroje umožňuje kratší separační časy, čímž se zkracuje celková doba analýzy.

Závěr

Za příplatek máme k dispozici několik analytických chromatografických technik k posouzení čistoty oligonukleotidů. V případě potřeby další pomoci se obraťte na naši skupinu technických služeb na adrese oligotechserv@sial.com.