Barviva Atto pro špičkové fluorescenční zobrazování

Aktivovaná fluorescenční barviva se běžně používají ke značení proteinů, nukleových kyselin a dalších biomolekul pro použití v přírodovědných aplikacích včetně fluorescenční mikroskopie, průtokové cytometrie, fluorescenční in situ hybridizace (FISH), testů vazby receptorů a enzymových testů. Barviva Atto jsou řadou fluorescenčních barviv, která splňují kritické potřeby moderních fluorescenčních technologií:

• Stabilita - Atto 655 a Atto 647N jsou fotostabilní a vysoce odolné vůči degradaci ozonem, takže jsou ideální pro aplikace na mikročipech. Viz související článek "Analýza vlastností fluorescenčních barviv používaných pro značení DNA v experimentech s mikročipy".
• Dlouhá doba života signálu - Doba rozpadu signálu 0,6-4,1 nanosekundy umožňuje časově omezit autofluorescenční pozadí a rozptyl.
• Snížené pozadí - Několik Atto barviv má excitační vlnové délky větší než 600 nm, což snižuje fluorescenci pozadí ze vzorků, Rayleighův a Ramanův rozptyl.
• Výběr - Atto barviva mají silné fluorescenční signály, které pokrývají viditelné a blízké IR emisní vlnové délky.

Dlouhá doba života signálu Atto barviv

Atto barviva vykazují delší dobu života fluorescenčního signálu (0,6-4,1 ns) ve vodném roztoku než karbocyaninová barviva nebo většina autofluorescence vlastní buňkám a biomolekulám. Signál z Atto barviv lze měřit pomocí pulzní laserové excitace s časově řízeným detekčním systémem, aby se snížily interference fluoroforů s kratší dobou života, autofluorescence pozadí a Rayleighova a Ramanova rozptylu světla, což zvyšuje celkovou citlivost.

Dlouhé excitační vlnové délky snižují pozadí

Bylo prokázáno, že excitace diodovým laserem při vlnové délce 635 nm a červeně absorbující fluorescenční barviva snižují autofluorescenci biologických vzorků natolik, že lze detekovat jednotlivé molekuly antigenů a protilátek ve vzorcích lidského séra.^1,2 Excitace v červené spektrální oblasti také snižuje poškození buněk při práci s živými buňkami.³

Mnoho barviv Atto (Atto 590 a vyšší) lze excitovat pomocí vlnových délek větších než 600 nm. Použití barviv Atto aktivovaných dlouhou vlnovou délkou ve spojení s vhodnou excitační vlnovou délkou snižuje autofluorescenci způsobenou vzorkem, rozpouštědlem, sklem nebo polymerním nosičem a zlepšuje celkovou citlivost při biologických analýzách a zobrazovacích technikách. Fluorescence na pozadí způsobená Rayleighovým a Ramanovým rozptylem se použitím excitace s delší vlnovou délkou rovněž výrazně snižuje.

Rozsah vlnových délek od 479 do 764 nm pro fluorescenční multiplexní detekci

Barviva Atto mají silné fluorescenční signály, přičemž většina z nich má hodnoty molární absorptivity >100 000 a nízký překryv excitace/emise, což činí barviva Atto ideálními pro multiplexní techniky využívající viditelné a blízké IR emisní vlnové délky.

S maximy excitačního signálu v rozmezí 390 až 740 nm a dobrou separací Stokesova posunu existují Atto barviva vhodná pro použití s jakýmkoli běžným zdrojem excitačního světla.

Fluorescenční multiplexní detekce pomocí Atto barviv

Atto barviva lze použít ke konjugaci sond a biomolekul pro multiplexní aplikace. Výběr dvou Atto barviv s oddělenými emisními signály podporuje vícenásobnou excitaci a výsledky měření z jediného experimentu.

Fluorescenční multiplexní detekce pomocí konjugátů s barvivy Atto protilátek

Imunoblotová detekce proteinu 1 a proteinu 2 pomocí dvou primárních protilátek a dvou konjugátů barviva anti-IgG-Atto. Zobrazování bylo prováděno postupně pomocí laserového skeneru Fuji® FLA-3000, nejprve při excitační vlnové délce 532 nm s emisním filtrem 580 nm, poté při excitační vlnové délce 633 nm s emisním filtrem 675 nm. Překrytí obrazu bylo provedeno pomocí softwarového nástroje.

Alternativy k běžným fluoroforům

Díky širokému výběru dostupných Atto barviv lze použít jakýkoli běžný zdroj excitačního světla a Atto barviva mohou nahradit jiná fluorescenční barviva běžně používaná v přírodních vědách.

Fluorofon	Doporučená alternativa barviva Atto
Alexa Fluor 488
FITC	Podrobněji viz níže.Atto 488
FAM™	Atto 488
FAM™	Atto 488
JOE™	Atto 520
TET™	Atto 520
Alexa Fluor 532	Atto 532
HEX™	Atto 532, Atto Rho6G
TAMRA™	Atto 550
TAMRA™	Atto 550
Cy3	Atto 550
Cy3.5	Atto 565
ROX™	Atto 565, Atto Rho11
Alexa Fluor 594	Atto 590, Atto 594
Červená texaská®	Atto 590
Alexa Fluor 633	Atto 633, Atto Rho14
Cy5	Atto 647, Atto 647N, Atto 655
Alexa Fluor 647	Atto 647, Atto 647N, Atto 655
Cy5.5	Atto 680, <.a href="/product/SIGMA/30674">Atto 700

Zdroj světla	Hlavní linie (nm)	Doporučená Atto barviva
Rtuťová oblouková lampa	365, 405, 436, 546<./td>	Atto 390, Atto 425, Atto 465, Atto 550, Atto 565
Rtuťová oblouková výbojka	577	Atto 590, Atto Rho101, Atto 594; Atto Rho13, Atto 610, Atto 611x
Xenonová oblouková výbojka	Kontinuum a špičky >800 nm	Atto 610, Atto 620, Atto 647, Atto 647N, Atto 655, Atto 680
Halogenová výbojka	Malá UV a fialová emise; vyšší intenzita směrem k delším vlnovým délkám	Atto 610, Atto 620, Atto 647, Atto 647N, Atto 655, Atto 680
Argonový iontový laser	488, 514	Atto 488, Atto 520, Atto 532, Atto 550
Argon-kryptonový laser	488, 514, 647, 676	Atto 520, Atto 647, Atto 647N, Atto 655, Atto 680
Kryptonový laser	647,676	Kryptonový laser
He-Ne laser	633	Atto Rho14, Atto 633, Atto 647, Atto 647N
Nd-NAG laser	532	Atto 532, Atto Rho6G, Atto 550, Atto 565, Atto Rho11, Atto Rho 12	Atto Rho6G, Atto 550, Atto 565, Atto Rho11, Atto Rho 12
Běžný diodový laser	635, 650, 670	Atto 633, Atto 647, Atto 647N, Atto 655, Atto 680

Reaktivní atobarviva a konjugáty

Atobarviva vytvářejí intenzivní fluorescenční signály díky silné absorbanci a vysokým kvantovým výtěžkům. Barviva jsou k dispozici v následujících formátech:

• Barviva s volnou kyselinou pro všechny běžné barvicí aplikace
• NHS-estery pro použití v běžných konjugačních protokolech
• Maleimidy pro použití při spojování se skupinami obsahujícími thiol, jako jsou cysteinové zbytky a thiol (-).SH) přidávané během automatické syntézy
• Konjugují se s biotinem, streptavidinem a protilátkami

Atto 655, Atto 680 a Atto 700 jsou zhášeny guanosinem, tryptofanem a příbuznými sloučeninami prostřednictvím přímého kontaktu mezi barvivem a zhášecím činidlem a pomocí procesu přenosu elektronů. Fluorescenční zhášení barviv tryptofanovými zbytky v bílkovinách bylo použito k rozlišení nevázaných (nefluorescenčních) bílkovin od interakcí mezi bílkovinou a protilátkou (fluorescenčních).¹

	λabs	ε max	λem	ηem	τem	Katalogové číslo
Barvivo	Nm	Příklad:	Barvivo	nm	%	Podle mého názoru se jedná o velmi vysoký podíl barviva.ns	Volná kyselina	NHS Ester	Maleimid	Azid	Amin	Jodacetamid	Biotin
Atto 390	390	24 000	479	90	3.8	89313	89204	89740	68321
Atto 425	436	45 000	484	90	3.5	56749	16805	49349	78948			28616
Atto 430LS	433	32 000	547	65	4.0	06714	56387	41882
Atto 465	453	75 000	508	55	2.2	50712	53404	55607
501	90 000	523	80	3.2	41051	41698	28562	72709	74417	74402	30574
Atto 490LS	496	40 000	661	30	2.6	06715	78362	78363	93688
Atto 495	495	80 000	527	45	2.4	16951	00379	41022
511	115 000	533	85	3.0	52595	67455	81062	44311	93728	80027	00713
Atto 520	516	110 000	538	90	3.8	70706	77810	16590	61911			01632
Atto 532	532	115 000	553	90	3.8	06699	88793	68499
Atto Rho6G	535	115 000	560	90	4.1	88821	93516	87785				94169
Atto 540Q<./td>	542	105,000				40592	61683	62453
554	120 000	576	80	3.2	42424	92835	30730	41986	39271		28923
Atto 565	563	120 000	592	90	3.4	75784	72464	18507	43069			92637
Atto Rho3B	565	120 000	592	50	1.5	93685	28743	76531				07876
Atto Rho11	571	120 000	595	80	4.0	56611	89101	51431				19096
Atto Rho12	576	120 000	601	80	4.0	44432	68761	72763				91254
Atto Thio12	579	110 000	609	15	2.0	56963		94079				87784
Atto Rho101	586	120 000	610	80	4.2	77085	50492	73522		&		94379
Atto 580Q	586	110.000				03722	44756	68152
Atto 590	594	120 000	624	80	3.7	70425	79636	39887				43208
Atto 594	601	120 000	627	85	3.5	08637	08741	08717	72998	61583		03927
Atto Rho13	600	120 000	625	80	3.9	16973	68538	44535				76141
Atto 610	615	150 000	634	70	3.3	78493	93259	41061				43292
Atto 612Q	615	115 000				04327	53988	50332
Atto 620	619	120 000	643	50	2.9	92716	67351	49728				72978
Atto Rho14	625	140 000	646	80	3.7	59746	61909	14397				76140
Atto 633	629	130 000	657	64	3.2	18620	01464	n/a	68517	73245	68652
Atto 647	645	120 000	669	20	2.3	97875	07376	41784
644	150 000	669	65	3.4	04507	18373	05316	91000	95349	73353	Podrobněji viz.93606
Atto 655	663	125 000	684	30	1.9	93711	76245	80661	11774	14918	73948	06966
Atto Oxa12	663	125 000	684	30	1.8	92606	55785	01971				61938
Atto 665	663	160 000	684	60	2.9	16851	04022	01407				01376
Atto 680	680	125 000	700	30	1.8	94875	.75999	04971				55819
Atto 700	700	120 000	719	25	1.5	30674	16986	50611	59825	19571		73911
Atto 725	729	120 000	752	10	0.5	47156	.93725	90979				69616
Atto 740	740	120 000	764	10	0.6	91394	59808	77071				50842
Atto MB2	658	100,000	Atto MB2			75118	73499	51797			nbsp;	02934

Výhodné konjugáty Atto Dye

K dispozici je rozsáhlý výběr konjugátů a sad Atto Dye, včetně:

• Sady pro značení proteinů
  • Atto 488 je lepší alternativou fluoresceinu a Alexa Fluor 488, vytváří konjugáty s větší fotostabilitou a jasnější fluorescencí.
  • Atto 550 je alternativou k rhodaminovým barvivům Cy3 a Alexa Fluor 550, která nabízí intenzivnější jas a vyšší fotostabilitu.
  • Atto 594 je alternativou k Alexa Fluor 594 a texaské červené.
  • Atto 647N je mimořádně vysoce fluorescenční barvivo a Atto 655 jsou alternativami k Cy5 a Alexa Fluor 647.
  • Atto 647N je mimořádně vysoce fluorescenční barvivo.
  • Atto 633 je alternativou k Alexa Fluor 633.

• Lektiny pro studie vazby sacharidů.

• Primární a sekundární protilátky pro přímou a nepřímou ELISA, imunoblotting, imunohistochemii a další aplikace identifikace proteinů.

• Biotin a streptavidin pro konjugaci avidin / streptavidin / biotin v aplikacích včetně ELISA, imunohistochemie, in situ hybridizace a průtokové cytometrie.

• NTA niklové konjugáty pro přímou detekci rekombinantních proteinů značených polyhistidinem.

Fluorescenční mikroskopie řezu lidské kožní tkáně (fixované v parafínu) s plísňovou infekcí. Cílový sacharid chitotrióza patogenních hub se specificky váže na lektin z konjugátu Phytolacca americana Atto 488 (zeleně). Jádra jsou protibarvena DAPI (modře). Obrázek: J. Zbären, Inselspital, Bern.

Protein p38 MAPK s jeho značkou (500 ng - 25 ng) byl separován na 4-20% Tris-glycinovém SDS-PAGE gelu. Po fixaci a promytí byl gel inkubován s Ni-NTA-Atto 647N (1:1000) ve tmě. Gel byl promyt a poté zobrazen pomocí laserového skeneru FLA-3000 Fuji^® s excitačním filtrem 633 nm a emisním filtrem 675 nm pro Ni-NTA-Atto 647N (λex 647 nm, λem 669 nm). Pomocí fluorescenčního zobrazování je pozorován pás 50 ng His značeného p38-MAPK.

Fosfolipidy značené barvivem Atto

Fosfolipidy jsou hlavními stavebními prvky biologických membrán. Výzkum biologických membrán (např. intracelulárních membrán živých buněk, plazmatických membrán) se stal hlavní oblastí zájmu. Nabízíme řadu fluorescenčně značených fosfolipidů. Optické vlastnosti vybrané řady barviv umožňují použití se všemi běžně používanými nastaveními excitačních a emisních filtrů. Nabízíme řadu fosfolipidů na bázi glycerolu nesoucího jednu nebo dvě mastné kyseliny (lipofilní skupiny) a fosfátový monoesterový zbytek (hydrofilní skupina), jako je 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamin (DPPE), 1,2-dioleoylsn-glycero-3-fosfoetanolamin (DOPE), 1-palmitoyl-2-hydroxy-snglycero-3-fosfoetanolamin (PPE) a 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamin (DMPE). Fluorofory jsou kovalentně vázány na hydrofilní hlavovou skupinu fosfolipidů.

Číslo výrobku: 1.	Popis
44039	Atto 488 DPPE
93580	Atto 532 DPPE
51016	Atto 550 DPPE
40924	Atto 594 DPPE
52816	Atto 633 DPPE
05152	Atto 647N DPPE	Atto 647N DPPE
67335	Atto 488DOPE
40692	Atto 532 DOPE
42208	Přístroj na výrobu a údržbu elektrických zařízeníAtto 550 DOPE
05676	Atto594 DOPE
90077	Atto 633 DOPE
42247	Atto 647N DOPE
54368	Atto 488 DMPE
06713	Atto 532 DMPE
42971	Atto 550 DMPE
72567	Atto 594 DMPE
55284	Atto 633 DMPE
	a href="/product/SIGMA/89522">89522	Atto 647 DMPE
51028	Atto 488 PPE
94092	Příslušenství k motorovým vozidlůmAtto 532 PPE
78998	Atto 550 PPE
19504	Atto 594 PPE
56530	Příslušenství k motorovým vozidlům, které se vyrábějí na základě smlouvy s výrobcem.Atto 633 PPE
91327	Atto 647N PPE

Odkazy

1. Neuweiler H, Schulz A, Vaiana AC, Smith JC, Kaul S, Wolfrum J, Sauer M. 2002. Detection of Individual p53-Autoantibodies by Using Quenched Peptide-Based Molecular Probes. Angew. Chem. Int. Ed.. 41(24):4769-4773. https://doi.org/10.1002/anie.200290044

2. Sauer M, Zander C, Müller R, Ullrich B, Drexhage K, Kaul S, Wolfrum J. 1997. Detection and identification of individual antigen molecules in human serum with pulsed semiconductor lasers. Applied Physics B: Lasers and Optics. 65(3):427-431. https://doi.org/10.1007/s003400050292

3. Sauer M, Zander C, Müller R, Ullrich B, Drexhage K, Kaul S, Wolfrum J. 1997. Detection and identification of individual antigen molecules in human serum with pulsed semiconductor lasers. Applied Physics B: Lasers and Optics. 65(3):427-431. https://doi.org/10.1007/s003400050292

4. Widengren J, Schweinberger E, Berger S, Seidel CAM. 2001. Two New Concepts to Measure Fluorescence Resonance Energy Transfer via Fluorescence Correlation Spectroscopy:  Theory and Experimental Realizations. J. Phys. Chem. A. 105(28):6851-6866. https://doi.org/10.1021/jp010301a

5. Buschmann V, Weston KD, Sauer M. 2003. Spectroscopic Study and Evaluation of Red-Absorbing Fluorescent Dyes. Bioconjugate Chem.. 14(1):195-204. https://doi.org/10.1021/bc025600x

6. Widengren J, Schwille P. 2000. Characterization of Photoinduced Isomerization and Back-Isomerization of the Cyanine Dye Cy5 by Fluorescence Correlation Spectroscopy. J. Phys. Chem. A. 104(27):6416-6428. https://doi.org/10.1021/jp000059s