Purifikace oligonukleotidů

Přehled sekcí

• Důležitost purifikace oliga
• Zdroje oligo nečistot a možnosti čištění
• Vysvětlení metod purifikace oliga
• Purifikační výzvy u oligosekvenování next gen
/a>
• Doporučení metod purifikace oligonukleotidů

Důležitost purifikace oligo

Purifikace oligonukleotidů je proces izolace syntetizovaných oligonukleotidů (krátkých sekvencí DNA nebo RNA) od nečistot, jako jsou neúplné sekvence, soli nebo organické vedlejší produkty. Tyto nečistoty vznikají při chemické syntéze oligonukleotidů a mohou ovlivnit kvalitu konečného produktu. Výběr optimální techniky purifikace oliga závisí na typu oliga a aplikaci. Optimální purifikace přináší významné výkonnostní výhody, mezi které patří:

Zvýšená přesnost

Nemčistoty mohou narušovat následné aplikace, jako je PCR, sekvenování nebo editace genů. Purifikované oligonukleotidy zajišťují vyšší specifičnost a přesnost vazby na cílové sekvence.¹

Zvýšená výkonnost

Vysoce čisté oligonukleotidy zvyšují účinnost vazby v molekulární diagnostice a výzkumných testech, jako je qPCR a hybridizace.²

Snížený šum pozadí

Odstranění kontaminantů z vedlejších produktů výroby oligoidů minimalizuje signály pozadí při molekulárních experimentech, což vede k přesnějším výsledkům.³

Konzistence v experimentech

Purifikace oliga zajišťuje reprodukovatelnost ve výzkumu, která je rozhodující pro získání spolehlivých a konzistentních výsledků při více testech.⁴

Mezi běžné metody purifikace patří odsolování, kartridžová purifikace, purifikace pomocí HPLC (vysoce účinná kapalinová chromatografie) a purifikace pomocí PAGE (polyakrylamidová gelová elektroforéza).

Zdroje oligo nečistot a možnosti čištění

Při výrobě DNA se každý nukleotid postupně připojuje k rostoucímu řetězci prostřednictvím <.a href="/CZ/cs/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/dna-oligonucleotide-synthesis">fosforamiditové chemie. V každém spojovacím cyklu se nízké procento oligonukleotidových řetězců neprodlouží, čímž vznikne směs plných (n) a zkrácených (n-1, n-2 atd.) sekvencí ("shortmerů"). Kromě toho jsou vedlejším produktem procesu štěpení a deprotekce malomolekulární nečistoty.

Po štěpení, deprotekci a odsolení (odstraní malomolekulární nečistoty) lze dalším čištěním oddělit požadovanou sekvenci plné délky od nežádoucích shortmerů.

Čistota požadovaná pro konkrétní techniku/aplikaci (Tabulka 1) závisí na potenciálních problémech způsobených přítomností shortmerů.

Dále lze oligonukleotidy, které obsahují běžné modifikace, např. biotin, Amino C2 dT atd. purifikovat jakoukoli níže popsanou metodou. Pro oligonukleotidy obsahující složitější struktury barviv, např. ROX™, TxRd (Sulforhodamin 101-X) atd. je vhodnou metodou HPLC; pouze ta dokáže odstranit volné barvivo, které by jinak narušovalo výkon zamýšlené techniky/aplikace.

Tabulka 1.Doporučené metody čištění podle techniky/aplikace.

Použití	Desalt	Kartridge	HPLC
Standardní PCR & RT-PCR	✓	✓
Sekvenační primery / sondy	✓	✓
Sondy pro qPCR			✓
Klonování			✓
Mikročipy	✓	✓	✓
Skrínování siRNA	✓	✓
Antisense			✓
Bioinženýrství			✓
Krystalografie, NMR			✓✓
použití in vivo			✓
NGS adaptéry

Vysvětlení metod purifikace oligoplastů

Purifikace oligoplastů odsolováním

Odsolováním se odstraní nečistoty malých molekul, např.např. akrylonitril vznikající při deprotekci fosfodiesterové páteře, které jsou zbytkovými vedlejšími produkty štěpení a deprotekce. Pro mnoho technik/aplikací, včetně PCR, je odsolování přijatelné pro oligonukleotidy ≤35 bází, protože převažující množství sekvence plné délky převažuje nad jakýmkoli příspěvkem krátkých (více informací o výpočet výtěžnosti). Oligonukleotidy >35 bází mohou vyžadovat dodatečné čištění, např. kartuší s reverzní fází (Cartridge).

Při čištění pouze odsolováním není zaručena žádná úroveň čistoty, protože tento proces neodstraňuje zkraty. Každý oligonukleotid je odsolen a bez dalších poplatků.

Purifikace oligonukleotidů pomocí kazety

Další úroveň čistoty nabízí separace na kazetě s reverzní fází (obrázek 1). Základem separace je rozdíl v hydrofobitě mezi sekvencí plné délky (má hydrofobní 5'-DMT skupinu) a shortmery (nemají 5'-DMT skupiny). Zatímco sekvence v plné délce zůstane na koloně zachována, zkrácené sekvence se vymyjí. Po rozštěpení 5'-DMT na patroně se eluuje a obnoví očekávaná sekvence plné délky. Kromě toho jsou oligonukleotidy modifikované určitými barvivy na 5'-konci, např. cyaninem nebo WellRED, kompatibilní s čištěním na kazetě díky zvýšené hydrofobicitě, kterou jim propůjčuje barvicí část.

S rostoucí délkou oligonukleotidu se zvyšuje podíl shortmerů obsahujících 5'-DMT skupinu (produkt vzniklý z necappovaných sekvencí). Tyto nežádoucí sekvence nebudou odstraněny purifikací v kazetě, a proto se pro delší oligonukleotidy doporučuje vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) nebo polyakrylamidová gelová elektroforéza (PAGE). Při čištění v kartuši není zaručena žádná úroveň čistoty. Dlouholeté zkušenosti však ukázaly, že 65 - 80 % sekvence plné délky (pomocí analytické HPLC) je běžné.

Purifikace oligo pomocí RP-HPLC

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie s reverzní fází (RP-HPLC) pracuje na stejném principu jako kazeta s reverzní fází (obrázek 1). Vyšší rozlišení však umožňuje dosáhnout vyšší úrovně čistoty. RP-HPLC je účinnou metodou purifikace oligonukleotidů s barvivy, protože jejich vnitřní hydrofobicita zajišťuje vynikající oddělení požadované sekvence od sekvencí, kterým barvivo chybí, shortmerů a shortmerů s delecemi. Kromě toho je RP-HPLC metodou volby pro rozsáhlou syntézu díky kapacitě a rozlišovacím vlastnostem kolony. Rozlišení na základě hydrofobicity však klesá s délkou oligonukleotidu. Proto se RP-HPLC obvykle nedoporučuje pro purifikaci oligonukleotidů >50 bází. Přestože lze touto metodou purifikovat delší oligonukleotidy (až 80 bází, v některých případech i více), může to mít nepříznivý vliv na čistotu a výtěžnost.

Standardní RP-HPLC obvykle dosahuje čistoty >85 % sekvence plné délky (pomocí analytické HPLC). V závislosti na složení sekvence lze dosáhnout vyšší čistoty. O přesné povaze toho, co RP-HPLC poskytuje z hlediska čistoty, a také o případných souvisejících poplatcích se informujte u místního prodejce nebo pracovníka zákaznického servisu.

Obrázek 1. Separace pomocí reverzní fáze: kartuše a HPLC. Standardní kartridžová i RP-HPLC purifikace probíhá s 5'-DMT na sekvenci.

1. Po vstupu do kolony se hydrofobní 5'-DMT požadované sekvence adsorbuje na pryskyřici stacionární fáze.
2. Krátké polymery, které nemají 5'-DMT, a proto nemohou interagovat s pryskyřicí, jsou vymývány mobilní fází.
3. 5'-DMT se odštěpí a požadovaná sekvence eluuje.

.

Purifikace oligonukleotidů pomocí IE-HPLC

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie s iontovou (konkrétně aniontovou) výměnou (IE-HPLC) je založena na počtu nabitých skupin (fosfátových) v páteři oligonukleotidu. Metoda aniontové výměny zahrnuje použití mobilní fáze s gradientem solí na kvartérní amoniové stacionární fázi (obrázek 2). Rozlišení je vynikající pro purifikaci menších množství. IE-HPLC je však omezena délkou, obvykle do 40 bází. Delší oligonukleotidy vedou k nižšímu rozlišení mezi sekvencí plné délky a krátkými; a tudíž k nižší a méně konzistentní čistotě.

Primárním důvodem pro použití IE-HPLC na rozdíl od RP-HPLC je purifikace oligonukleotidů s významnou sekundární strukturou, které se obvykle vyskytují v sekvencích s vysokým obsahem GC. IE-HPLC je pro takové oligonukleotidy účinná, protože mobilní fáze má vysoce alkalické pH, které narušuje vodíkové vazby, a tedy i sekundární strukturu. Po této technice může následovat RP-HPLC, která separačnímu procesu dodá druhý rozměr. Informujte se prosím o zaručeném procentuálnímu zastoupení sekvence plné délky.

Obrázek 2. Separace pomocí IE-HPLC. Purifikace IE-HPLC probíhá bez 5'-DMT na sekvenci.

1. Po vstupu do kolony vytvářejí polyaniontové fosfáty surové směsi interakce náboj-náboj s polykationtovou pryskyřicí stacionární fáze.
2. Při zvyšování iontové síly mobilní fáze se krátké polymery vymývají.
3. Dlouhá, požadovaná sekvence eluuje naposledy při ještě vyšší iontové síle.

Purifikace oligonukleotidů pomocí PAGE

Polyakrylamidová gelová elektroforéza (PAGE) využívá denaturační prostředí k oddělení oligonukleotidů na základě molekulové hmotnosti na rozdíl od náboje (obrázek 3). Za vhodných podmínek lze rozlišit oligonukleotidy lišící se o jedinou bázi. Toto vynikající rozlišení podle velikosti má obvykle za následek nejvyšší dosažitelnou úroveň čistoty ze všech dostupných purifikačních metod. Minimální výtěžky z PAGE jsou nižší než z jiných metod kvůli složitému postupu, který je nutný pro extrakci oligonukleotidů. Tato technika se doporučuje, pokud je požadována vysoká čistota a pro sekvence ≥50 bází. PAGE obvykle dosahuje čistoty >95 % sekvence plné délky. Přesnou povahu toho, co PAGE poskytuje z hlediska čistoty, a také případné související poplatky zjistíte u svého místního prodejce nebo pracovníka zákaznického servisu.

Obrázek 3. Oddělení prostřednictvím STRÁNKY. Na gel se působí elektrickým polem, které způsobí, že se polyaniontový oligonukleotid dostane ke kladně nabité anodě. Protože je náboj rovnoměrně rozložen v celé surové směsi, jsou různé sekvence separovány na základě molekulové hmotnosti, tj. délky. Krátké sekvence se pohybují rychleji, zatímco delší, požadované sekvence se pohybují pomaleji.

Purifikace oligonukleotidů gelovou filtrací

Gelová filtrace se doporučuje pro menší množství oligonukleotidů určených pro experimenty in vivo (obrázek 4). V závislosti na místě výroby mohou fosforothioátové oligonukleotidy (S-Oligos), které se často používají pro studie in vivo s antisense, projít gelovou filtrací (ověřte si prosím u místního prodejce nebo pracovníka zákaznického servisu, zda je tato úprava dostupná ve vaší zeměpisné oblasti). Při tomto čištění se odstraní stopová množství vedlejších produktů syntézy, štěpení a deprotekce (které nebyly odstraněny standardním odsolováním) a také purifikační rozpouštědla. Tyto stopové vedlejší produkty, které jsou obvykle neškodné in vitro , mohou vést k cytotoxickým účinkům in vivo .

Další možnosti in vivo jsou k dispozici s naším produktem iScale Oligos™ pro větší množství.

Obrázek 4. Separace pomocí gelové filtrace. Purifikace gelovou filtrací probíhá bez 5'-DMT na sekvenci.

1. Po vstupu do kolony prochází směs požadované sekvence s různými vedlejšími produkty a nečistotami rozpouštědla pryskyřicí stacionární fáze.
2. Při průtoku mobilní fáze vstupují menší nečistoty do pórů gelu, čímž se jejich postup matricí zpomaluje; požadovaná sekvence do pórů gelu nevstupuje, a proto prochází matricí a eluuje se jako první.
3. Nepříměsi nakonec projdou póry gelu a matricí; a jsou vymyty.

Purifikační výzvy u oligosekvenátorů Next-Gen

Výše uvedené tradiční purifikační metody jsou účinné při odstraňování nečistot malých molekul i při zvyšování procenta sekvence plné délky na žádoucí úroveň. Další typ nečistot, křížová kontaminace, se objevil jako problém v důsledku neustálého růstu používání extrémně citlivých technik, jako je sekvenování nové generace (NGS).⁵ Tradiční purifikační metody nejsou účinné při odstraňování křížové kontaminace oligonukleotidů. Malá množství křížové kontaminace jsou realitou v každém vysoce výkonném výrobním zařízení oligonukleotidů. Taková malá množství obvykle nemají žádný znatelný dopad na tradiční techniky/aplikace, jako je PCR. Většina platforem NGS se však při multiplexování spoléhá na indexové adaptéry (čárové kódy). Pokud je malé množství nesprávného čárového kódu (v důsledku křížové kontaminace) přidáno k nesprávnému sekvenačnímu cíli, problém je nezjistitelný až do fáze analýzy dat, což tento problém činí časově a finančně nákladným. Pro zamezení tohoto problému byly vyvinuty oligos pro sekvenování nové generace (NGSO). NGSO se vyrábí pomocí vlastních purifikačních metod a doporučuje se pro jakýkoli oligonukleotid určený k použití jako adaptér NGS.

Doporučení pro purifikační metody oligonukleotidů

Oligonukleotidy se nejlépe purifikují různými metodami nebo kombinací metod v závislosti na zamýšleném použití. Pro začátek se podívejte do Tabulky 1, kde jsou uvedeny doporučené metody v závislosti na technice/použití. Kromě toho se obraťte na naši skupinu technických služeb na adrese [email protected], abyste optimalizovali svou metodu purifikace oligo. Máme více než 35 let zkušeností s navrhováním, výrobou, úpravou a čištěním olig DNA a RNA.

Související produkty

Litujeme, vyskytla se neočekávaná chyba.

Network error: Failed to fetch

Odkazy

1. 02-04-2008. Oligonucleotide synthesis: methods and applications. [dissertation]. Springer Science & Business Media: Herdewijn P, editor.

2. Beaucage S, Caruthers M. 1981. Deoxynucleoside phosphoramidites—A new class of key intermediates for deoxypolynucleotide synthesis. Tetrahedron Letters. 22(20):1859-1862. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(01)90461-7

3. Goodchild J. 1990. Conjugates of oligonucleotides and modified oligonucleotides: a review of their synthesis and properties. Bioconjugate Chem.. 1(3):165-187. https://doi.org/10.1021/bc00003a001

4. Caruthers MH. 1985. Gene Synthesis Machines: DNA Chemistry and Its Uses. Science. 230(4723):281-285. https://doi.org/10.1126/science.3863253

5. Luthra R, Chen H, Roy-Chowdhuri S, Singh R. Next-Generation Sequencing in Clinical Molecular Diagnostics of Cancer: Advantages and Challenges. Cancers. 7(4):2023-2036. https://doi.org/10.3390/cancers7040874