Stabilizace RNA v RNAstable®
Sharron Ohgi, Laurent Coulon, Rolf Muller, Judy-Muller-Cohn, Omoshile Clement
Úvod
RNAstable® je nový konzervační přípravek vyvinutý k ochraně RNA před degradací během skladování nebo přepravy při okolních teplotách. Syntetické skladovací médium je založeno na přírodních principech anhydrobiózy (což znamená "život bez vody"), což je biologický mechanismus používaný některými organismy, který jim umožňuje přežít v suchu po dobu více než 100 let. Anhydrobiotické organismy chrání svou DNA, RNA, proteiny, membrány a buněčné systémy pro přežití v suchém stavu a mohou být oživeny jednoduchou rehydratací. Přípravek RNAstable byl navržen tak, aby tyto jedinečné vlastnosti napodoboval a stabilizoval RNA při okolní teplotě po delší dobu. Kvantitativní analýza RT-PCR prokazuje úspěšnou amplifikaci templátů RNA, které byly skladovány v suchu v přípravku RNAstable po dobu 29 měsíců při pokojové teplotě a za podmínek zrychleného stárnutí, které odpovídají 12 letům skladování při pokojové teplotě (zvýšená teplota 45 °C). Vzorky byly uzavřeny v sáčku s bariérou proti vlhkosti včetně vysoušecího obalu, aby byly zajištěny ideální podmínky skladování. Rehydratované vzorky byly použity přímo v reakcích bez dalšího čištění a nevykazovaly žádnou inhibici ani ztrátu aktivity. Tato inovativní technologie zabraňuje degradaci RNA při pokojové teplotě a nabízí obrovské úspory nákladů a energie jako snadno použitelná alternativa k běžnému skladování v mrazničce.
Experiment
Celková RNA byla extrahována ze zmrazených buněk 293T pomocí přípravku TRIzol® podle pokynů výrobce. Alikvoty (500 ng) extrahované celkové RNA byly přidány do RNAstable® v 96jamkové destičce a ponechány přes noc zaschnout v laminární průtokové digestoři. Usušené vzorky byly skladovány po dobu 29 měsíců jak při pokojové teplotě v uzavřeném sáčku s bariérou proti vlhkosti včetně vysoušecího obalu, tak při teplotě 45 °C.2 Referenční kontrolní vzorky byly rovněž skladovány při teplotě -80 °C po totožnou dobu (29 měsíců). Vzorky RNA uložené v RNAstabilu byly rehydratovány v 25 µl vody ošetřené DEPC na konečnou koncentraci 20 ng/µl. Byla provedena sériová ředění na konečnou koncentraci 2pg/µl. Nechráněné vzorky byly připraveny stejným způsobem. Alikvot 5 µl (10 pg) každého vzorku byl použit jako templát pro expresi genu 18S rRNA pomocí soupravy TaqMan® One-Step RT-PCR (ABI). Pro každý dopředný a reverzní primer v reakci byla použita konečná koncentrace 400 nM. Byla použita konečná koncentrace 250 nM sondy 18S rRNA (5'-značené FAM a 3'-značené TAMRA). Reakce byly připraveny v konečném objemu 25 µl.
Výsledky a diskuse
Obrázky gelu,3 skóre bioanalyzátoru RIN,3 a výsledky RT-PCR (Obrázek 1) získané pro vzorky RNA skladované v přípravku RNAstable buď při pokojové teplotě, nebo při 45 °C jsou podobné jako při -80 °C, což naznačuje, že přípravek RNAstable nabízí stejnou úroveň ochrany jako skladování v chladu. Zjistili jsme, že optimální ochranu vzorků RNA před degradací při pokojové teplotě poskytuje skladování ve zkumavkách nebo jamkových destičkách RNAstable a jejich umístění do tepelně uzavřeného sáčku s bariérou proti vlhkosti a vysoušedlem. Obnova RNA z RNAstable probíhá jednoduchou hydratací a vzorek je připraven k použití bez dalšího čištění v následných aplikacích, jako je qRT-PCR, transkripce in vitro, Bioanalyzer a expresní analýza. RNAstable nabízí výzkumným pracovníkům možnost skladovat a přepravovat RNA při pokojové teplotě bez ztráty kvality vzorku, a to při výrazné úspoře nákladů na materiál, práci a dopravu.
Obrázek 1.Výsledky jednofázové RT-PCR vzorků RNA skladovaných v RNAstabilu při pokojové teplotě a 45 °C oproti skladování při -80 °C (kontrola) kvantifikované pomocí genu 18S rRNA. Pro každou podmínku skladování byly amplifikovány tři vzorky a výsledky z 9 reakcí jsou překryty grafem.
Odkazy
Sponzorovaný příspěvek. BioTechniques 48:470 (červen 2010) doi 10.2144/000113453
Abyste mohli pokračovat ve čtení, přihlaste se nebo vytvořte účet.
Nemáte účet?