Kvantifikace DNA a RNA

Přesné stanovení koncentrace a výtěžnosti nukleové kyseliny je důležité pro následné aplikace včetně transfekce, klonování, PCR a sekvenování nové generace (NGS). Tyto aplikace mají často specifickou cílovou koncentraci nukleové kyseliny pro optimální výkon. Nepřesná kvantifikace může zvýšit variabilitu navazujících testů a ovlivnit kvalitu výsledků. Kvantifikaci DNA a RNA lze provádět některou z následujících metod:

• UV absorbance (optická hustota)
• Měření fluorescence pomocí barviv vázajících nukleové kyseliny
• .Elektroforéza v agarózovém gelu
• qPCR

Kvantifikace DNA pomocí UV absorbance

Nejběžnější technikou používanou ke stanovení koncentrace i čistoty nukleových kyselin je absorbance. Měření absorbance lze použít k odhadu koncentrace DNA nebo RNA v přečištěných vzorcích. Při této metodě se vzorek nukleové kyseliny umístí do křemenné kyvety, která se poté vloží do UV spektrofotometru. Spektrofotometry s malým objemem, jako je přístroj NanoDrop™, spektrofotometr DeNovix DS-11 a spektrofotometr Blue-Ray Bio EzDrop, umožňují pomocí podstavců analýzu vzorků o objemu pouhého 1 µl. UV světlo prochází vzorkem při stanovené délce dráhy a koncentrace nukleových kyselin lze přímo vypočítat měřením hodnot absorbance při 260 nm oproti slepému vzorku pomocí Beerovy-Lambertovy rovnice:

A = εcl

kde:

A = UV absorbance
ε = extinkční koeficient závislý na vlnové délce
c = koncentrace nukleové kyseliny
l = dráha světla (cm)

Extinkční koeficienty*:

• dsDNA (čistá): 0,020 (µg/ml)^-1 cm^-1
• ssDNA (čistá): 0,027 (µg/ml)^-1 cm^-1
• ssRNA (čistá): 0,027 (µg/ml): (µg/ml)^-1 cm^-1

*Je důležité poznamenat, že tento vzorec platí pouze pro velké molekuly nukleových kyselin s poměrným složením nukleotidů, jako je genomová DNA nebo plazmidy. U oligonukleotidů a jiných krátkých molekul nukleových kyselin, jako jsou miRNA, by se měl extinkční koeficient vypočítat na základě sekvence oligonukleotidu.

Pro zvýšení přesnosti se měření A₂₆₀ často koriguje na zákal (měřený pomocí absorbance při 320 nm) pomocí následující rovnice:

Koncentrace (µg/ml) = (A₂₆₀ měření - A₃₂₀). měření) x konverzní faktor nukleové kyseliny** x faktor ředění

**Konverzní faktor pro dsDNA: 50 µg/ml
**Konverzní faktor pro ssDNA: 37 µg/ml
**Konverzní faktor pro ssRNA: 40 µg/ml

Celkový výtěžek pak získáte vynásobením koncentrace nukleové kyseliny konečným celkovým objemem přečištěného vzorku.

Čistota DNA (bílkovinné kontaminanty) = A₂₆₀ čtení ÷ A₂₈₀ čtení

K vyhodnocení chemické kontaminace lze použít poměr absorbance při 260 nm a 230 nm. Je známo, že zbytkové chaotropní soli a organická rozpouštědla, která mohou inhibovat PCR, absorbují světlo v oblasti 230 nm. Poměr A₂₆₀/A₂₃₀ by měl být >1,5 pro aplikace, které jsou citlivé na chemické rušení, včetně enzymových testů, jako je qPCR a sekvenování. Čím nižší je poměr, tím větší je množství organických sloučenin nebo chaotropních solí v přípravku.

Čistota DNA (chemické kontaminanty) = A₂₆₀ čtení ÷ A₂₃₀ čtení

Fluorometrické metody pro kvantifikaci

Fluorometrické metody jsou všeobecně považovány za jedny z nejcitlivějších dostupných metod pro kvantifikaci nukleových kyselin. Tyto metody používají fluorescenční barviva, která interkalují a vážou drážky nukleových kyselin, nespecificky vážou DNA nebo RNA nebo selektivně vážou nukleový materiál. Rozdíly ve spektrálních charakteristikách fluoroforů vázaných na nukleové kyseliny pak umožňují stanovit koncentraci vzorku.

Každé barvivo nukleové kyseliny má specifickou excitační a emisní vlnovou délku. Vzorek DNA nebo RNA se měří pomocí fluorometru a koncentrace nukleových kyselin se pak vypočítá porovnáním emise fluorescence vzorku s fluorescenční křivkou vytvořenou pomocí standardů se známou koncentrací nukleových kyselin. Různé typy vzorků (genomová DNA, plazmidová DNA atd.) vyžadují vlastní standardní křivky. Stejně jako u absorpčních metod se vypočtené koncentrace musí podle potřeby korigovat na faktor ředění.

Úvahy při výběru fluorescenčního barviva nukleových kyselin pro kvantifikaci:

• Specifičnost: různá barviva jsou optimalizována pro měření dsDNA, ssDNA, RNA nebo malých RNA (např, miRNA) na základě jejich mechanismu vazby a spektrálních vlastností - ujistěte se, že jste vybrali fluorescenční barvivo, které se váže na váš cíl zájmu


• Citlivost: Vysoce citlivá fluorescenční barviva vám umožní použít méně vzorku nebo měřit velmi nízké koncentrace nukleové kyseliny


• Dynamický rozsah: některá činidla lze použít k detekci nukleové kyseliny při nízkých koncentracích, ale při vyšších koncentracích mohou ztrácet linearitu; použité činidlo musí být vhodné pro očekávaný koncentrační rozsah vašich vzorků


• Objem vzorku: pokud je objem vašeho vzorku omezený, věnujte pozornost objemu vzorku požadovanému činidlem nebo soupravou


• Formát vzorku: některá činidla a soupravy byly optimalizovány pro měření v jednotlivých zkumavkách nebo kyvetách, zatímco jiné jsou určeny pro použití v mikrotitračních destičkách pro vyšší výkon


• Instrumentální filtry: zkontrolujte, zda má váš fluorometr vhodné excitační a emisní filtry pro vybrané barvivo

Kvantifikace DNA a RNA pomocí gelové elektroforézy

Protože elektroforéza v agarózovém gelu odděluje DNA a RNA od ostatních nečistot, odstraňuje tato metoda kvantifikace některé problémy spojené s výpočty založenými na měření absorbance. Při elektroforéze v agarózovém gelu se vzorek izolované DNA nebo RNA vloží do jamky agarózového gelu, který je umístěn v elektrickém poli. Záporně nabitá nukleová kyselina migruje směrem k anodě, čímž se oddělí fragmenty DNA a RNA podle velikosti a tvaru. Elektroforéza v agarózovém gelu má navíc tu výhodu, že umožňuje vizualizaci kontaminujících pásů a střižených nečistot ve vzorku. Koncentraci a výtěžnost nukleové kyseliny lze určit porovnáním intenzity pásů vzorku se standardy známého množství. Protože DNA a RNA absorbují světlo při vlnové délce 260 nm, lze intenzitu měřit pomocí UV transiluminátoru. Vyšší citlivosti lze dosáhnout označením vzorků nukleových kyselin a standardů barvivem nukleových kyselin, jako je ethidium bromid nebo SYBR® Green, a měřením intenzity při stanovené vlnové délce tohoto barviva. Pokud má vzorek neředěné DNA o objemu 2 µl vložený do gelu stejnou intenzitu jako standard o objemu 100 ng, pak je koncentrace vzorku 50 ng/µl (100 ng ÷ 2 µl). Standardy používané pro kvantifikaci by měly mít stejnou velikost jako analyzovaný vzorek nukleové kyseliny a měly by být podobně označeny.

Obrázek 1. Elektroforéza připravené DNA v agarózovém gelu. První čtyři dráhy ukazují větší množství střižných nebo nízkomolekulárních kontaminantů nukleových kyselin v přípravku.

Kvantifikace pomocí PCR v reálném čase (qPCR)

PCR v reálném čase neboli kvantitativní PCR (qPCR) využívá fluorometrické sondy, které vážou cílovou DNA během fáze žíhání PCR, nebo fluorescenční barviva, která vážou dvouřetězcovou DNA. Ke sledování fluorescenčního signálu v průběhu amplifikace se používají specializované termální cyklery vybavené moduly pro detekci fluorescence. Naměřená fluorescence je úměrná celkovému množství DNA. Ke stanovení množství cílové DNA v testovaných vzorcích se používá standardní křivka. Ke kvantifikaci DNA je možné použít také metody digitální PCR bez standardní křivky.

V případě kvantifikace RNA je templátem PCR komplementární DNA (cDNA), která se získává reverzní transkripcí RNA.

Jednou z klíčových výhod PCR v reálném čase je možnost kvantifikace specifických cílových sekvencí na základě množství amplifikovatelné nukleové kyseliny. To může být výhodné při kvantifikaci genomové DNA, kdy se při měření nezohledňuje množství střižné DNA a menších fragmentů DNA a RNA přítomných ve vzorku. Mezi další výhody patří detekce inhibitorů v reakční směsi a inherentní specifičnost fluorometrických sond.

Obrázek 2. Kvantitativní PCR (qPCR) byla provedena pomocí fluorescenčního barviva SYBR Green a desetinásobného ředění templátu.

Závěry

Vhodnou metodu kvantifikace DNA nebo RNA je třeba zvolit na základě mnoha faktorů, včetně dostupnosti zařízení, zamýšlené následné aplikace a výkonnosti. Některé metody kvantifikace mají další výhodu v tom, že umožňují stanovit biologickou a chemickou čistotu vzorku. Při porovnávání výtěžnosti mezi jednotlivými metodami je třeba postupovat opatrně, protože přítomnost kontaminantů může vést k interferenci měření, což má za následek nadhodnocení nebo podhodnocení výtěžnosti.