Řešení problémů s přípravou RNA

Před použitím připravené RNA v následné aplikaci je vhodné zkontrolovat kvalitu, čistotu a výtěžnost RNA. Řešení problémů v navazujících aplikacích může vyžadovat návrat k připravenému vzorku RNA. Nejprve zkontrolujte kvalitu a čistotu RNA pomocí RIN, poměru 28s:18s a poměru A₂₆₀/A₂₈₀ jak je uvedeno výše. Pokud je kvalita RNA špatná, je to pravděpodobně příčinou špatných výsledků v následných aplikacích. V tomto případě došlo buď k degradaci RNA před zpracováním vzorku, nebo k degradaci RNA během přípravy. Příprava RNA by se měla opakovat s čerstvými vzorky a s větší opatrností, aby se zabránilo kontaminaci RNázou během postupu. Pokud je kvalita RNA dobrá, zkontrolujte výtěžnost RNA. Pokud je kvalita RNA dobrá, ale výtěžek je nižší, než se očekávalo, může to být způsobeno neúplnou lýzou buněk, špatnou vazbou nebo špatnou elucí, pokud se používá purifikace křemíkem. Příprava RNA by se měla opakovat s větší pečlivostí, aby se zajistilo úplné rozrušení vzorku a úplná lýza buněk. Pokud je výtěžnost RNA nižší, než se očekávalo, může být nutné RNA koncentrovat nebo připravit více RNA (např. zvýšit vstupní množství vzorku). Pokud je kvalita, čistota a výtěžnost RNA dobrá, může být problém v následné aplikaci (tabulka 1). 

Tabulka 1. Možné příčiny a řešení problémů, které mohou nastat při přípravě RNA.

Problém	Možná příčina	Řešení
RNA je degradovaná/je nízké kvality/čistoty (např.g., nízká hodnota RIN, nízký poměr 28s:18s nebo rozmazání na gelu, nízký poměr A260/A280 [< 1.9])	Vstupní vzorek nebyl správně skladován/nebylo s ním správně manipulováno.	Endogenní RNázy mohly RNA degradovat. Dodržujte doporučení pro skladování a manipulaci se vzorkem. Rychle přidejte dostatečné množství chaotropu nebo denaturačního činidla k inaktivaci RNáz ve vzorku. Nenechávejte vzorek rozmrazit, pokud je již zmražený.
	RNázy byly vneseny během/po zpracování vzorku.	Ujistěte se, že vždy nosíte rukavice a často je měníte. Dodržujte další laboratorní postupy pro ošetření skleněného a plastového nádobí a roztoků, které přijdou do styku s RNA.
	Purifikovaná celková RNA nebyla správně skladována.	Dodržujte doporučené podmínky skladování, abyste minimalizovali degradaci. RNA skladujte při teplotě -80 °C, zejména po delší dobu.
Celková RNA obsahuje genomickou DNA	Při přípravě nebyla použita denáza nebo byla nedostatečná.	Ošetřete DNázou. Ujistěte se, že jste DNázu po ošetření zcela odstranili. V případě purifikace na oxidu křemičitém, pokud bude provedeno štěpení DNázy na koloně, promyvací kroky odstraní DNázu. Případně proveďte fenol/chloroformovou extrakci, vysrážejte RNA a znovu ji rozpusťte ve vodě bez RNázy.
	Purifikační systém byl přetížen.	Postupujte podle doporučení pro velikost vzorku pro váš purifikační systém.
Výtěžek celkové RNA je nízký	Je-li výtěžek nízký, ale kvalita je dobrá:
	Výchozí materiál má nízký obsah RNA nebo byl použit nesprávný výchozí materiál (tj.e., místo cílového orgánu byla použita nějaká pojivová tkáň). Pro metody založené na oxidu křemičitém: Eluce nebyla účinná.	Použijte správný výchozí materiál nebo více výchozího materiálu. Nepřetěžujte purifikační systém. Do středu kolony naneste alespoň 50 μl vody.
	Jestliže je výtěžnost i kvalita nízká: Výchozí vzorek nebyl správně skladován/nebylo s ním správně manipulováno.	Mohlo dojít k degradaci RNA endogenními RNázami. Dodržujte doporučení pro skladování a manipulaci se vzorkem. Rychle přidejte dostatečné množství chaotropu nebo denaturačního činidla k inaktivaci RNáz ve vzorku.
	RNázy byly vneseny během/po zpracování vzorku.	Ujistěte se, že neustále používáte rukavice a často je měníte. Dodržujte přísné laboratorní postupy pro ošetření skleněného nádobí, plastového nádobí a roztoků, které přijdou do styku s RNA.
	Vzorek nebyl důkladně narušen/homogenizován.	Dodržujte doporučení pro narušení/homogenizaci pro váš typ vzorku.
Celková RNA se v následné aplikaci chová suboptimálně	Je-li kvalita RNA špatná:	Podívejte se na tipy pro řešení problémů s nekvalitní RNA.
	Jestliže je kvalita RNA dobrá: Ve vzorku mohou být stále přítomny kontaminanty.	Nepřetěžujte purifikační systém. To může mít za následek špatný výtěžek a/nebo sníženou čistotu celkové RNA. Pokud byla použita organická rozpouštědla, mohou být ve vzorku přítomna zbytková rozpouštědla. RNA vysrážejte pomocí soli a alkoholu. V případě nízkých koncentrací RNA přidejte inertní koprecipitant (např, glykogen).
	Při purifikaci křemíku pomocí ethanolového promývacího pufru: ve vzorku zůstanou zbytky ethanolu.	Ujistěte se, že jste vzorek důkladně vysušili na vzduchu (např, extra odstředění) před elucí.
	Přítomna je genomická DNA.	Viz tipy pro řešení problémů výše.
Pro mRNA: Vzorek obsahuje značné množství rRNA	Vzorek nebyl důkladně narušen/lyzován.	Postupujte podle doporučení pro narušení/lyzaci pro váš typ vzorku.
	Oligo(dT) purifikační systém byl přetížen.	Dodržujte doporučení pro velikost vzorku pro váš purifikační systém. Vzorek může vyžadovat druhé kolo oligo(dT) chromatografie.