Návrh testu PCR/qPCR/dPCR

A Technical Guide to PCR Technologies

Přečtěte si více informací

• Výběr amplikonů
• Metylačně specifické testy
• Návrh primeru
• Návrh sondy
• Syntéza a zpracování oliga
• Purifikace oligonukleotidů
• Příprava oligonukleotidů

Celý pracovní postup PCR je náchylný k faktorům, které vnášejí variabilitu. Mnohým proměnlivým složkám se nelze vyhnout, například zdroji vzorku nebo požadavku na krok reverzní transkripce. Návrh testu je také velmi variabilní a může rozhodovat o úspěchu a neúspěchu PCR a také přispívá k reprodukovatelnosti a citlivosti testu. Proces navrhování testů probíhá logicky: Prvním krokem je určení požadovaného cílového umístění. V některých případech je sekvence olig určena aplikací a nelze se jí vyhnout, např. detekce SNP, v jiných případech lze použít celý gen, např. stanovení počtu kopií. Jakmile jsou vybrána přibližná místa testu, identifikují se nejvhodnější primery a určí se jejich modifikace. Pokud mají být testy prováděny v multiplexu, je důležité zvážit potenciál interakce všech olig v reakci a také relativní množství cílů. V náročných situacích, např. když je cílem detekovat velmi nízký počet kopií nebo malé rozdíly v koncentraci cíle, je vhodné vybrat a otestovat několik kombinací primerů a poté je zkombinovat s vhodnou sondou.

Proces návrhu testu je značně usnadněn přijetím vhodného softwaru pro návrh. OligoArchitect poskytuje dvě možnosti podpory návrhu. První z nich je OligoArchitect Online, softwarový návrhový nástroj s širokou škálou možností. Pokud návrh vyžaduje specializované schopnosti, druhou možností je vyžádat si návrh prostřednictvím služby OligoArchitect Consultative s využitím pomoci našich odborných molekulárních biologů.

Výběr ampliconu

Amplikon je oblast cílové sekvence, která má být analyzována a kterou zahrnují přední a zpětné primery PCR. Určení velikosti amplikonu částečně závisí na metodě, která se má pro analýzu použít. Při vizualizaci fragmentů PCR pomocí gelové elektroforézy musí být fragment PCR dostatečně velký, aby se dal účinně obarvit pomocí barviva vážícího DNA a vešel se do rozsahu zvoleného umělého markeru velikosti. Podobně při rozlišení fragmentu pomocí přístroje pro kapilární elektroforézu bude mít produkt PCR velikost mezi 100 páry bází a kdekoli nad 2 kb (případně omezen výkonem enzymu).

Při použití qPCR pro konečné odečty se volí menší amplikon, aby byla zajištěna přesná kvantifikace v každém cyklu. V ideálním případě se velikost amplikonu qPCR pohybuje v rozmezí 75 až 200 bází, pokud omezení návrhu nevedou k tomu, že primery přesahují tento rozsah. Ve skutečnosti může být velikost fragmentu určena na základě zvážení několika faktorů, včetně zvažované biologie.

Místo testu může být předem určeno cíli experimentu: V ideálním případě jsou testy pro stanovení přítomnosti nebo množství cílové mRNA umístěny nad exon-exonovou spojnicí, aby se zabránilo detekci kontaminujících sekvencí gDNA. Tyto oblasti jsou však často velmi složité, a proto je třeba pragmaticky rozhodnout, zda dát přednost zkoušce procházející exonem s potenciálně horší výkonností, nebo zkoušce procházející exonem s vyšší kvalitou. Pokud je mRNA hojná a přepisovaná z jedné kopie genu, bude příspěvek signálu z kontaminace gDNA podstatně méně významný než při detekci málo hojného transkriptu z genu s více kopiemi. Detekce SNP vyžaduje umístění sondy nebo 3' primeru nad místo neshody.

Analýza sestřihových variant vyžaduje přístup k návrhu, který je specifický pro daný cíl. V některých případech je žádoucí detekovat všechny sestřihové varianty současně a toho lze jednoduše dosáhnout výběrem hranice exonu, která je zachována mezi všemi variantami. Zkoumání rozdílné exprese jednotlivých sestřihových variant však vyžaduje kreativnější přístup. V jednom příkladovém experimentu je cílem prozkoumat, který z alternativních transkriptů, zobrazených na obrázku 6.1, je exprimován. Protože exony jsou relativně malé, amplifikace napříč všemi exony vede k produktu o velikosti přibližně 300 bází, přičemž menší produkty vznikají amplifikací sestřihových variant. Možnosti návrhu pro tuto studii by byly následující:

• Navrhnout několik testů napříč každým spojením exonů a sondovat každý vzorek každým testem.
  
• Navrhnout primer na 3' exonu 1 a 5' exonu 4.
• Navrhnout primer na 3' exonu 1 a 5' exonu 4.
• Navrhnout primer na 3' exonu 1 a 5' exonu 4. Amplifikace jakéhokoli transkriptu složeného z jakékoli kombinace exonů by vedla k amplikonu určité délky. Definice transkriptu by se určila pomocí qPCR, křivky tání barviva SYBR Green I po reakci.

Obrázek 6.1. Schematické znázornění genu vyjádřeného jako čtyři potenciální sestřihové varianty. Každou sestřihovou variantu lze rozlišit navržením specifických párů primerů napříč každým exonovým spojením nebo amplifikací z obecného páru primerů v exonech 1 a 4 a rozlišením sestřihových variant pomocí qPCR, analýzy tání barviva SYBR Green I.

Všeobecně by se amplikonové sekvence měly posuzovat podle následujících kritérií:

• Doporučuje se úvodní posouzení oblasti cílové sekvence.
  
• Ujistěte se, že se v ní nevyskytují žádné neočekávané SNP. Jediná neshoda mezi primerem a templátem může snížit teplotu tání až o 10 °C, což ovlivní účinnost PCR.
  
• Ujistěte se, že vybraná sekvence nemá homologii s žádnou jinou sekvencí v genomu/transkriptomu cílového druhu. Při cílení na systémy s více organismy, např, detekce patogenů, musí určení homologie zahrnovat všechny sekvence, které mohou být ve vzorku.
  
• Ověřte potenciál cílové sekvence přijmout sekundární strukturu pomocí skládacího algoritmu programu OligoArchitect, vybraného návrhového softwaru nebo programu mfold (http://mfold.rna.albany.edu/) k modelování skládání templátu při požadované teplotě žíhání primeru. Vyberte oblasti templátu, které mají předpovězenou otevřenou strukturu tím, že se vyhnete sekundárním strukturám kmenové smyčky s velmi zápornými hodnotami ΔG. To je důležitý aspekt při použití jednostupňového protokolu reverzní transkripce a primerů specifických pro daný gen.
  
• Vyhněte se palindromickým sekvencím a repetitivním oblastem.
  
• Vyhněte se oblastem bohatým na G/C a usilujte o přibližně 50% obsah GC.
  
• Při navrhování multiplexních testů by měly být amplikony co nejpodobnější, co se týče délky a obsahu CG, aby se zabránilo zkreslené amplifikaci.
• Při navrhování testů pro genové rodiny identifikujte oblasti homologie nebo heterogenity (podle potřeby). Sekvence by pak měly být zarovnány a prozkoumány na úseky vhodné konsenzuální sekvence.
  
• Při návrzích specifických pro transkripty (aby se zabránilo detekci gDNA templátů) se zaměřte na oblasti nad exon-exonovým spojením, pokud je to možné.

Výběr amplikonů specifických pro transkript

Většina, ale ne všechna DNA je ze vzorku odstraněna během čištění RNA. Aby se zabránilo amplifikaci DNA během RT-qPCR, doporučuje se vybrat primery, které buď obklopují velký intron, který není přítomen v sekvenci mRNA, nebo které překlenují exon-exonovou spojku (obrázek 6.2).

Intronové/exonové anotace pro známé geny mnoha druhů obratlovců, bakterií, protist, hub, rostlin a bezobratlých metazoí jsou k dispozici na webových stránkách EnsemblGenomes (http://ensemblgenomes.org/). Případně, pokud jsou veřejně dostupné jak genomické sekvence, tak sekvence cDNA pro cílový gen, lze pozice intronů určit provedením vyhledávání BLAST se sekvencí cDNA proti genomické databázi pro cílový organismus (obrázek 6.3). Intron 1 na obrázku 6.3 je dostatečně dlouhý (~6,5 kb), aby DNA nebyla amplifikována za běžných podmínek qPCR nebo kontrolovaných podmínek PCR. Všechny ostatní introny jsou však relativně krátké (<1 kb), a proto je pravděpodobné, že se DNA během RT-qPCR amplifikuje (příklad: Assay Optimization and Validation). Primery by měly buď pokrývat exon-exonové spoje, obklopovat dlouhý (několik kb) intron, nebo obklopovat více malých intronů.

Obrázek 6.2. Ilustrace (A) intron-spanning a (B) intron-flanking primerů pro RT-PCR. Introny jsou červeně a exony zeleně. Primery P1 a P2 pokrývají intron a primery P3 a P4 obklopují intron. Všimněte si, že primery P1 a P2 nevytvoří z DNA produkt PCR, pokud není teplota žíhání extrémně nízká. Primery P3 a P4 mohou z DNA vytvořit delší produkt PCR, pokud je intron krátký (~1 kb), ale ne, pokud je dostatečně dlouhý (několik kb).

Obrázek 6.3. Zarovnání sekvence cDNA s genomovou DNA pomocí BLAST. Kompletní sekvence cDNA pro krysí p53 z Genbank (přístupové číslo NM_030989) byla použita při vyhledávání identických sekvencí v genomu krysy pomocí megaBLAST (blastn). Je uvedeno zarovnání cDNA s gDNA na chromozomu 10. Na základě těchto informací lze zarovnat exony cDNA s odpovídajícími oblastmi gDNA a navrhnout primery pro exony, které jsou odděleny dlouhými introny, např. exony 1 a 2.

Metylačně specifické testy

Metylace DNA je klíčovou součástí buněčné diferenciace, která způsobuje stabilní změnu genové exprese. Metylace je důležitá pro normální vývoj vyšších organismů a může být dědičná. Regulace genů prostřednictvím metylace DNA zahrnuje přidání metylové skupiny do polohy 5 pyrimidinového kruhu cytosinu nebo dusíku 6 purinového kruhu adeninu. V dospělých somatických tkáních se metylace DNA obvykle vyskytuje v kontextu CpG dinukleotidů, zatímco v embryonálních kmenových buňkách převažuje metylace bez CpG. Testy specifické pro metylaci vyžadují identifikaci ostrovů CpG v sekvenci, často v oblasti genového promotoru. Tyto informace jsou automaticky vyhledány při použití programu Beacon Designer (Premier Biosoft) a jsou k dispozici na http://www.mybioinfo.info/index.php.

Návrh primerů

Zatímco obecné návrhy na návrh primerů a sond popsané v této kapitole jsou použitelné pro řadu aplikací, včetně studií genové exprese, detekce SNP, studií detekce metylace, stanovení počtu kopií, monitorování virové zátěže a kvantifikace sestřihových variant, každá aplikace má také specifické úvahy o návrhu, které budou diskutovány samostatně.

Obecná kritéria návrhu primerů

Pro většinu aplikací jsou primery navrženy tak, aby byly plně komplementární k templátovým sekvencím DNA, které mají primerovat. Mezi základní kritéria návrhu primerů pro PCR patří:

• Primery mají obvykle délku 20-24 nukleotidů s teplotou tání (T_m) přibližně 60 °C
  (59±2 °C) pro qPCR, ale mohou se lišit (55±5 °C) pro běžnou PCR. Specifické aplikace mohou vyžadovat modifikace délky primerů a T_m.
  
• Páry primerů by měly mít 40-60% obsah GC a neměly by mít výraznou sekundární strukturu.
  
• Primery by neměly být komplementární k sobě samým nebo partnerským primerům, zejména na 3' konci. Tím se snižuje možnost vzniku primer-dimerových produktů během amplifikace.
  
• Vyhněte se 3' upínání (prozkoumejte 5 bází na 3' a 3 z nich přijměte jako A nebo T a 2 jako G nebo C).
  
• Vyhněte se běhům stejného nukleotidu, které jsou delší než 4 opakování nebo palindromickým oblastem.

Primery specifické pro jednotlivé SNP

Primery specifické pro jednotlivé SNP2. Primery ARMS jsou dlouhé 30 bází (delší primery, až 60 bází, jsou funkční). Báze na 3' je specifická pro SNP, a proto je specifická pro cílovou sekvenci (normální nebo mutovanou bázi). Na předposlední pozici je zavedena další neshoda. Ta je určena s ohledem na sousední báze a neshodu SNP (Tabulka 6.1 převzato z Little, 2001).

Tabulka 6.1. Výběr neshody předposlední báze pro primery ARMS.Přetištěno se souhlasem Current Protocols in Human Genetics. Little, S. 2001. Amplification-Refractory Mutation System (ARMS) Analysis of Point Mutations. Curr. Protoc. Genet. 7:9.8.1-9.8.12.

3' Base in Primer Matching to WT	.Neshodná báze v templátu mutanta pod koncovými bázemi SNP primeru	Báze kódujícího vlákna párující se s předposlední bází v primeru
				A	C	G	T
A	A	A	G	A	A	G
G	A	C	Př.T	A	G
C	A<	G	A	C	T
T	T	C	T	A	G
G	T	G	T	C nebo T
C	T	C	T	A	G
C	C	C	T	C	C	T	G
G	G	A	G	A	G

Tabulka 6.2Příklad potenciálního hybridizačního párování specifických a neshodných primerů pro detekci mutace G>A. Přídavná neshoda přidaná k předposlední bázi primeru vede k větší destabilizaci a zabraňuje elongaci, která může nastat u primeru, který má na 3' konci jedinou neshodu.

	Normální cílová sekvence	Mutantní cílová sekvence
Normální primer	3' CGTTAGACGAT. ..5' .......G CAATCTGCTA...	3'CGTTAGACGAT. ..5 .......ACAATCTGCTA..
Normální primer s přidanou předposlední neshodou	3'CCTTAGACGAT. ..5' ......GCAATCTGCTA.......	3'CCTTAGACGAT.. .5' ....ACAATCTGCTA.....
MutantPrimer s Penultimate	3'TgrTAGACGAT....5' ...... GCAATCTGCTA.....	3'TgT AGACGAT.. .5' ......ACAATCTGCTA..
Mutantní primer s přidanou předposlední neshodou	3'TgrTAGACGTA...5' ......GCAATCTGCTA.....	3T CTTAGACGAT.. .5 ....ACAATCTGCTA....

Přetištěno se souhlasem Current Protocols in Human Genetics. Little, S. 2001. Amplification-Refractory Mutation System (ARMS) Analysis of Point Mutations (Analýza bodových mutací pomocí systému ARMS). Curr. Protoc. Hum. Genet. 7:9.8.1-9.8.12.

Další výzkumné skupiny použily podobné myšlenky a prokázaly užitečnost zavedení neshod v pozicích N-2 a N-3 v primerech, Liu a spol.³ provedli hloubkovou analýzu relativních pozic neshod pro největší destabilizační účinek, a tedy nejvyšší specificitu.

Multiplexní PCR

Množení několika cílů současně v multiplexní PCR je nutné v případě, že je snaha zvýšit výkonnost pomocí více PCR na zkumavku nebo ušetřit materiál vzorku. Návrh primerů je nejkritičtějším faktorem úspěšné multiplexní PCR. Je velmi důležité, aby byly dodrženy obecné pokyny a aby byla ověřena kompatibilita všech primerů (a sond), které mají být zahrnuty do reakce. V některých případech může být výhodné použít o něco delší primery s T_m kolem 65 °C. Mají-li být výsledné amplikony analyzovány na základě diskriminace velikosti, je třeba při návrhu testu zohlednit rozlišovací schopnost analýzy. Při pokusu o kvantifikaci více cílů pomocí qPCR by si amplikony měly být co nejpodobnější, aby se zabránilo zkreslení amplifikace. Kromě primerů je důležité, aby templát nemohl přijmout stabilní sekundární strukturu, protože by to bránilo PCR. Pokud je známo, že se cíle vyskytují ve výrazně odlišných koncentracích, může být výhodné zařadit k cíli o vysoké koncentraci blokovací primer, aby se usnadnila přesná detekce cíle o nižší koncentraci⁴.

Kvantifikace nekódující RNA

Odhaduje se, že na rozdíl od kódujícího genomu je ~97 % lidského transkriptomu tvořeno nekódující RNA (ncRNA)^5;6,7. Jedním z členů této skupiny jsou dlouhé nekódující RNA, které byly popsány jako třída regulačních molekul RNA. Tyto molekuly hrají roli v epigenetice, vývoji, rakovině a základních biologických procesech^8,9. Dlouhé ncRNA jsou tradičně definovány jako složené z vláken RNA o délce nejméně 200 bází^10,11,12. To znamená, že po rozpoznání délky amplikonu není třeba při navrhování těchto cílů brát v úvahu žádné zvláštní ohledy kromě těch, které již byly zmíněny.

Naproti tomu členové rodiny, kterou tvoří mikroRNA (miRNA), představují značnou výzvu při navrhování. Jedná se o krátké nekódující RNA (sncRNA) o délce 21-23 nt, které vznikají složitou buněčnou cestou v několika fázích zpracování transkriptu. MikroRNA negativně regulují translaci proteinů vazbou na transkript (přehled v Kato et al., 2008¹³) a indukují tvorbu komplexu RISC (RNA induced silencing complex)¹⁴. Komerční testy, jako je MystiCq^® line, jsou vítaným řešením problémů s návrhem, které miRNA představuje. Bylo navrženo několik schémat qPCR pro analýzu miRNA¹⁵ a pro ty, kteří studují organismy, pro něž neexistují komerční produkty, existuje několik publikací popisujících možná řešení. Mnohá z nich spočívají v přidávání bází k původní miRNA pomocí ligování adaptéru (kapitola 22, Casoldi, et al., in PCR Technologies; Current Innovations ed Nolan¹⁶) nebo přidáním poly-A ocasu pomocí polyA polymerázy (PAP)¹⁷. Přidání značky ke každému z primerů specifických pro miRNA umožňuje optimalizovat hybridizační T_m a bylo prokázáno, že reakce obsahující primery DNA jsou účinnější než reakce s příměsí uzamčené nukleové kyseliny¹⁸. V této zprávě byly primery DNA specifické pro miRNA navrženy podle běžných pokynů pro primery PCR s dalšími úvahami:

• Prozkoumejte sekvenci miRNA a neberte v úvahu všechny terminální báze A na 3'. - Určete přední primer jako nejdelší úsek sekvence od 5' po terminální 4 báze 3' (ignorujte výše identifikované báze A).
  
• Je výhodné, aby jedna ze 2 bází na 3' předního primeru byla A nebo T.
  
• Je výhodné, aby 3 báze na 3' obsahovaly 1 nebo 2 A nebo T.
  
• Je výhodné, aby 5 bází na 3' obsahovalo 2-3 A nebo T.
  
• Analyzujte T_m předního primeru pomocí algoritmu nejbližšího souseda. Pokud je nižší než 59 °C, přidejte k 5' následující báze v daném pořadí a po každém přidání vypočítejte T_m : G,A,C,G,C (výsledkem je primer ve tvaru CGCAGN₁₈ kde N jsou specifické báze miRNA). Vyberte nejkratší primer s T_m nejblíže 59 °C. Pokud je vyšší než 59 °C, odstraňte 5' báze a vypočítejte T_m po každém odstranění báze. Vyberte nejdelší primer s T_m nejblíže 59 °C.
• Vyberte 3' báze pro reverzní primer a ujistěte se, že nejsou komplementární s dopředným primerem. Posuďte koncové 5 báze, jak je popsáno u dopředného primeru.
  
• Přidejte 15×T k primeru (např, 5' T₁₅ N₅ 3').
  
• Analyzujte T_m přímého primeru pomocí algoritmu nejbližšího souseda. Pokud je tato hodnota nižší než 59 °C, přidejte k 5' primeru následující báze v daném pořadí a po každém přidání vypočítejte T_m : G,A,C,C, T,G,G,A,C, C (výsledkem je primer ve tvaru CAGGTCCAG T₁₅ N₅ kde N jsou specifické báze miRNA). Vyberte nejkratší primer s T_m nejblíže 59 °C.
  
• Primer RT je CAGCTCCAG T₁₅ V N (kde V=A, C a G a N=A,C,G,T).

Příklad návrhu primeru

Protože cílové sekvence diktují sekvence primerů, nemusí být vždy možné dosáhnout požadovaných kritérií návrhu. Kompromisy při návrhu testu se proto překonávají optimalizací specifickou pro daný test. Některé cíle PCR mohou vyžadovat speciální zpracování, než bude možné navrhnout úspěšnou analýzu. Často se vyskytující případ se týká detekce patogenů, včetně virů. Je dobře známo, že mnoho virů má vysoký stupeň variability na specifických místech svého genomu. Dobrým příkladem je virus hepatitidy B. V nedávné studii bylo pro návrh úspěšného qPCR testu proti známým variantám HBV¹⁹ nutné provést rozsáhlé zarovnání všech dostupných genomických sekvencí HBV. Několik set sekvencí bylo porovnáno pomocí programu ClustalW ve snaze najít významné úseky konsensuální sekvence, které by mohly být použity pro obecný návrh testu. Úryvek výsledku zarovnání je zobrazen na obrázku 6.4. Hvězdičky (*) představují konsenzuální nukleotidy nalezené při analýze všech genomů (velké množství dalších sekvencí, které byly součástí tohoto zarovnání, není zobrazeno kvůli nedostatku místa).

Obrázek 6.4. Částečná analýza dat genomu HBV pomocí programu ClustalW. Všechny známé genomové sekvence HBV byly zarovnány pomocí programu ClustalW a byly identifikovány konzervativní nukleotidy (*).

Při navrhování primerů a sond v takových situacích může být nutné použít oligos, které obsahují smíšené báze, známé také jako "wobbles" nebo degenerované báze. Vezměme si například detaily konsenzuální sekvence uvedené pro HBV (obrázek 6.5).

Obrázek 6.5. Vybraná oblast zarovnání HBV s vyznačením oblastí shody

Pro primer je zapotřebí oblast přibližně dvaceti tří bází. V tomto případě je při zvážení všech možností sekvence pro všechny genomy HBV skutečná sekvence této oblasti o dvaceti třech bázích znázorněna na obrázku 6.6:

Obrázek 6.6. Permutace sekvence primerů pro všechny možnosti bází pro vybranou oblast konsensuálního primeru.

Pozice nejednoznačných bází lze znázornit pomocí standardních jednopísmenných kódů pro smíšené báze (Tabulka 6.3). Pokud je aplikujeme na sekvenci zobrazenou na obrázcích 6.5 a 6.6, lze oligo popsat podle obrázku 6.7.

Tabulka 6.3Jednopísmenné směsné základní kódy.

Kód		Smíšené základy
B	C	G	T		B
D		G	T	A
H	C		T	A
K		G	T
M	C					A
N	C	G	T	A
R		G		A
S	C	G
V	C	G		A
W				T	A
Y	C		T

A = adenosin, C = cytidin, G = guanosin, T = thymidin

Obrázek 6.7. Nejednoznačné báze konsenzuální oblasti oligo jsou reprezentovány standardními jednopísmennými kódy.

Tato možnost pravděpodobně nepovede k úspěšnému PCR primeru, protože je třeba řešit další otázky týkající se vysokého počtu degenerovaných bází. Zejména syntetické oligo vyrobené pomocí této sekvence by ve skutečnosti vedlo ke směsi každé z možných sekvencí jednotlivých bází. Počet možných jednotlivých sekvencí primerů se vypočítá vynásobením čísel jednotlivých bází na každé pozici. Pro tuto sekvenci to znamená 1×2×1×1×1×2×1×1×1×2×2×1×3×2×1×2×2×2×2×1×1×1×2×1×1 = 6 144 možných jednotlivých olig. Efektivní koncentrace každého konkrétního oliga v reakci se tedy úměrně snižuje. Empirická analýza ukázala, že počet různých permutací sekvence v primeru by neměl být větší než 512, proto by tento příklad nebyl optimálním primerem s degenerovanou bází. Potenciální řešení by nabízela změna návrhu na jiné místo. V příkladu uvedeném na obrázku 6.8 obsahuje primer 2 báze s potenciálními neshodami. Každá z nich má však jednu alternativní bázi, takže ve smíšené syntéze jsou 4 oligosyntézy a wobble se nacházejí v 5' oblasti primeru. Tyto faktory nabízejí mnohem větší šanci na úspěch než primer uvedený na obrázku 6.7.

Obrázek 6.8. Sekvence zobrazující zarovnání konsensuálních bází a potenciální umístění primeru do konsensuální oblasti. Konsenzuální primer je znázorněn pomocí wobble kódů

Při použití degenerovaných olig v PCR může být nutný upravený amplifikační protokol. Cyklování lze zahájit 2-5 cykly při nízké teplotě žíhání (35-45 °C). Rovněž by měl být zařazen pomalý náběh z teploty žíhání na teplotu prodlužování, přičemž dosažení teploty prodlužování trvá přibližně 3-5 minut. Protokol by pak měl být ukončen 25-40 cykly při přísnější teplotě žíhání bez úpravy rampy.

Pokud je to možné, je vhodnější vyhnout se heterogenitě nukleotidů. Pokud není možné vyhnout se oblastem heterogenity, což je často případ obtížných cílů, pak je vhodné použít specializované oligo modifikace, jako je inosin a další "univerzální" báze, například 5-nitroindol, mohou pomoci snížit složitost a přidat modifikační skupiny, jako je uzamčená nukleová kyselina (viz Quantitative PCR and Digital PCR Detection Methods) může zlepšit výkonnost.

Modifikace primerů

Do primerů PCR je možné začlenit modifikované nukleotidy. Běžným příkladem je přidání uzamčené báze nukleové kyseliny. Uzamčená nukleová kyselina je modifikovaný nukleotid RNA. Ribozová část Locked Nucleic Acid je modifikována dodatečným můstkem spojujícím 2' kyslík a 4' uhlík (Quantitative PCR and Digital PCR Detection Methods). Tento můstek "uzamyká" ribózu v konformaci 3'-endo. Uzamčená nukleová kyselina může být smíchána s bázemi DNA nebo RNA v oligonukleotidu, kdekoli je to žádoucí. Modifikace uzamčené nukleové kyseliny vede ke zvýšené tepelné stabilitě, což umožňuje navrhovat kratší sondy s ekvivalentem T_m delšího, nemodifikovaného ekvivalentního primeru. Sekvence obsahující uzamčenou nukleovou kyselinu jsou specifičtější než oligosložené pouze z DNA a ideálně se hodí pro detekci SNP. Mezi další aplikace modifikací uzamčených nukleových kyselin patří navrhování olig pro analýzu obtížných sekvencí, jako jsou viry, u nichž může vysoký stupeň variability ztěžovat návrh obecného testu²².

Návrh sondy

Stejně jako u primerů PCR závisí i návrh sondy qPCR do značné míry na kontextu sekvence a požadované aplikaci. Jednotlivé sondy, jako jsou duálně značené sondy nebo molekulární majáky, jsou obvykle dlouhé 20-30 bází. Sondy Scorpions^® mají kratší sondu o délce 15-25 bází. V systému LightCycler nebo FRET jsou dvě sondy; senzorová (sonda 1) a kotevní (sonda 2), které jsou umístěny v těsné blízkosti, oddělené 1-5 bází.

• Při použití dvojitě značených sond by T_m měla být o 7 °C až 10 °C vyšší než u primerů, aby se zajistilo, že se sonda naváže na cíl dříve, než dojde k hybridizaci a prodloužení primerů. To platí i pro obě sondy FRET v reakci. Při použití pro detekci SNP je senzorová sonda (sonda 1) umístěna nad místem neshody, vyhýbá se koncovým 3 bázím sondy a má nižší T_m  (asi 5 °C) než kotevní sonda (sonda 2). Sondy Scorpions^® jsou výjimkou z tohoto doporučení, protože sonda se váže na nově syntetizovaný templát po extenzi, a nikoli před ní, jako je tomu u jiných sondových systémů.
  
• Při kvantitativních studiích s použitím dvojitě značených sond se snažte, aby sonda byla umístěna blízko 3' předního primeru, ale nepřekrývala se (přibližně pět bází); pro detekci SNP umístěte dvojitě značenou sondu nebo molekulární maják do středu amplikonu a SNP do středu sondy.
• Vyhněte se guanidinu na 5' konci sondy vedle reportéru, protože způsobuje zhášení.
• Ujistěte se, že v sekvenci sondy je méně G než Cs.
  
• Vyhněte se běhům stejných bází (<4) a palindromickým sekvencím.
  
• Ujistěte se, že sonda nemůže přijmout sekundární strukturu.
  
• Zajistěte, aby sonda nemohla hybridizovat s primery.
  
• Při navrhování sond pro multiplexní reakce zajistěte, aby mezi žádnou ze sond a primerů nedocházelo k potenciálním interakcím.

Molekulární majáky

Podrobněji se věnujte této problematice.Po výběru vhodné oblasti sondy se na 5' a 3' konec přidají komplementární stonky a vytvoří se struktura Molecular Beacon²⁰. Níže uvedený příklad ukazuje přidání kmenové sekvence (červeně) k dvojitě značené sondě za účelem vytvoření molekulárního majáku (obrázek 6.9 převzato z Thelwell 2000²¹).

Obrázek 6.9. Přizpůsobení testu s dvojitě značenou sondou formátu molekulárního majáku. Nucleic acids research by Oxford University Press. Reprodukováno se souhlasem Oxford University Press ve formátu pro opakované použití v knize/e-knize prostřednictvím Copyright Clearance Center.

Scorpions^® Sondy

Sonda Scorpions^® vyžaduje sestavení sondy s předním primerem tak, aby přijaly strukturu: 5' dyestem-probe-stem-quencher-blocker-primer. Primer a sonda musí být na opačných vláknech, protože sonda se váže na nově vytvořený templát, který je na stejném vlákně jako primer. Příklad uvedený na obrázku 6.10 ukazuje přidání značení, zhášeče, PCR blokátoru a kmenové sekvence k duálně značené sondě pro vytvoření sondy Scorpions^® (upraveno podle Thelwell 2000²¹).

Obrázek 6.10. Adaptace testu s dvojitě značenou sondou na formát sondy Scorpions®. Výzkum nukleových kyselin podle Oxford University Press. Reprodukováno se souhlasem Oxford University Press ve formátu pro opakované použití v knize/e-knize prostřednictvím Copyright Clearance Center.

Modifikace sond

Pokud jsou sondy umístěny nad oblastí sekvence s nežádoucí heterogenitou, nejednoznačné báze se spravují tak, jak je popsáno u primerů PCR. Podobně lze k sondám přidat uzamčenou nukleovou kyselinu ze stejných důvodů, z jakých se přidává k primerům.

5' dvojitě značené sondy, molekulárního majáku nebo sondy Scorpions^® je označeno fluoroforem, obvykle 6-FAM™. pro jednotlivé testy nebo při multiplexování, obvykle se volí v pořadí FAM, HEX™/JOE™, cyanin 5 (rozhodující je určit kompatibilitu značky s přístrojem). 3' dvojitě značené sondy nebo molekulárního majáku a 3' konec vnitřní kmenové oblasti sondy Scorpions^® jsou modifikovány molekulou zhášeče. Historicky se jako akceptor pro emise FAM používalo barvivo TAMRA, což vedlo k zhášení FAM. Vývoj technologie tmavých zhášečů vedl k širokému rozšíření zhášečů Black Hole Quencher™ a k novějšímu zavedení naší kolekce zhášečů Onyx Quencher™ (viz Metody kvantitativní PCR a digitální PCR detekce).

Šablona kontrol

Jednou z výhod použití relativně krátkých amplikonů, které mají obvykle méně než 150 bází, je, že je pak možné syntetizovat dlouhý oligonukleotid, který lze použít jako syntetický amplifikační cíl. Použití takového cíle může pomoci při vývoji a optimalizaci testů, kde může být zamýšlený cíl vzácný nebo ho může být nedostatek, například v testu kontroly inhibice SPUD²³  (viz Příloha A) nebo studie detekce infekčních onemocnění¹⁹.

Syntéza oliga a manipulace s ním

Při objednávání vlastních olig pro použití v aplikacích PCR je třeba rozhodnout o požadovaném výtěžku/rozsahu syntézy, čistotě a požadovaných úpravách. Každý z těchto faktorů ovlivňuje ostatní, např, vyšší úroveň purifikace povede k lepší kvalitě oligonukleotidu, ale za cenu snížení celkového výtěžku. Tabulky 6.4, 6.5 a 6.6 poskytují vodítko, pokud jde o rozsah syntézy a očekávaný výtěžek námi vyráběných oligonukleotidů.

Purifikace oligonukleotidů./span>

Při syntéze DNA se každý nukleotid připojuje k rostoucímu řetězci postupně, počínaje 3' koncem sekvence. V každém cyklu spojování se malé procento řetězců oligo neprodlouží, což vede ke směsi plnohodnotného produktu a zkrácených sekvencí. Po odštěpení oliga od nosiče a odstranění ochranných skupin se purifikací oddělí produkt plné délky od zkrácených sekvencí. Obecně čistota požadovaná pro konkrétní aplikaci závisí na potenciálním vlivu přítomnosti zkrácených oligomerů. Pro některé aplikace je rozhodující, aby bylo přítomno pouze oligo plné délky (n). U jiných, jako jsou primery PCR, nemusí přítomnost kratších olig (n-1,n-2,...) ovlivnit výsledky experimentu.

Odsolidace

Odsolidační postup odstraňuje zbytkové vedlejší produkty, které zůstaly po syntéze, štěpení a deprotekci.

Pro mnoho aplikací, včetně PCR, je odsolovací purifikace přijatelná pro oliga, která nejsou delší než 35 bází, protože převažující množství oliga plné délky převáží jakýkoli příspěvek kratších produktů. Oligos potřebná pro klonování nebo delší než 35 bází vyžadují další metodu purifikace, jako je například reverzně-fázová kartridžová purifikace (RP1), HPLC nebo PAGE (v závislosti na délce).

Purifikace na kazetě s reverzní fází (RP1)

Separace na kazetě s reverzní fází odstraní vysoký podíl zkrácených sekvencí. Jako základ separace se používá rozdíl v hydrofobicitě mezi produktem plné délky a zkrácenými sekvencemi. Zatímco oligo v plné délce zůstává na koloně, zkrácené sekvence jsou vymyty. Požadovaný produkt plné délky je poté eluován a odstraněn z patrony.

Reverzní fáze HPLC

S rostoucí délkou oliga má podíl zkrácených sekvencí tendenci se zvyšovat. Ne všechny tyto nečistoty budou odstraněny pomocí RP1, a proto se u delších olig, jako jsou olig umělého amplikonového templátu nebo značených sondových olig, doporučuje purifikace pomocí HPLC nebo PAGE. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie s reverzní fází (RP-HPLC) funguje na stejném principu jako kazeta s reverzní fází. Vyšší rozlišení však umožňuje dosáhnout vyšší úrovně čistoty. HPLC je účinnou metodou čištění oligosloučenin s fluorofory, jako jsou sondy qPCR, protože jejich vlastní lipofilita zajišťuje vynikající oddělení produktu od kontaminantů. Kromě toho je RP-HPLC metodou volby pro větší měřítka díky kapacitě a rozlišovacím vlastnostem kolony. Rozlišovací schopnost založená na lipofilitě se snižuje s rostoucí délkou oliga. Proto se RP-HPLC obvykle nedoporučuje pro čištění produktů delších než 50 bází. Ačkoli lze touto metodou purifikovat delší oligosloučeniny (až 80 bází), čistota a výtěžnost mohou být nepříznivě ovlivněny.

Anion-exchange HPLC

Anion-exchange separace je založena na počtu fosfátových skupin v molekule. Metoda purifikace s aniontovou výměnou zahrnuje použití eluce s gradientem solí na koloně s kvartérní amoniovou stacionární fází nebo podobnou strukturou. Rozlišení je vynikající pro purifikaci menších množství. Tuto techniku lze spojit s purifikací pomocí RP-HPLC, čímž se separační proces rozšíří o druhý rozměr. Aniontově-výměnná HPLC je omezena délkou oliga (obvykle do 40 polymerů). Čím delší jsou oligonukleotidy, tím nižší je rozlišení na koloně aniontově-výměnné HPLC, a tudíž nižší čistota cílového oliga.

Polyakrylamidová gelová elektroforéza (PAGE)

Základem separace pomocí PAGE je náboj nad molekulovou hmotností, což vede k dobrému rozlišení velikosti, což vede k čistotě 95-99 % produktu plné délky. Výtěžnost při PAGE je nižší než při jiných metodách kvůli složitým postupům nutným pro extrakci oligos z gelu a odstranění převážné většiny zkrácených produktů. Tato technika se doporučuje, pokud je požadován vysoce purifikovaný produkt. PAGE je doporučenou purifikací pro delší oligos (≥50 bází).

Tabulka 6.4 Očekávaný výtěžek pro standardní oligo s ohledem na metodu čištění.

Standard Oligos (OD/μg)*
Scale (μmol)	Desalt	Kartridž	Kartridž	HPLC	PAGE
0.025	3/90	NA	NA	NA
0.05	5/150	1/30	1/30	0.5/15
0.2	12/360	3/90	2.5/75	1/30
1.0	40/1,200	12/360	13/390	5/150
10	400/12,000	NA	Nástupce: 1: center;">130/3,900	NA
15	600/18,000	NA	Na: center;">190/5,700	NA

*Záruka platí 20 let nebo déle. Kratší oligosy mohou mít menší počet OD.

Tabulka 6.5Očekávaný výtěžek pro modifikovaná oliga s ohledem na metodu čištění.

Standard Oligos (OD/μg)*
Scale (μmol)	Desalt	Kartridž	Kartridž	HPLC	PAGE
0.05	2/60	0.4/12	0,4/12	0.2/6
0.2	5/150	1/30	1/30	0.4/12
1.0	16/480	5/150	5/150	2/60
10	160/4,800	N/A	52/1,560	N/A
N/A
15	240/7,200	N/A	76/2,280	240/2,280	N/A

*Záruka platí 20 let nebo déle. Kratší oligosy mohou mít méně OD.
Poznámka: Post-syntetickými úpravami lze získat o 50 % méně než výše uvedené hodnoty.

Tabulka 6.6Garantovaná množství pro sondy qPCR.

Kvantita (OD)
Dvojitě značené sondy	1	3	10		10
Molekulární majáky	1	3	10		10
LightCycler Probes	0.1	0,25	1.5		15
Scorpions® Sondy	1	5	10		N/A

Všechny sondy jsou purifikovány pomocí RP-HPLC.

Příprava oligonukleotidů

Oligonukleotidy DNA dodávané v suchém stavu jsou po opětovné suspenzi připraveny k použití. Doporučuje se resuspendovat oligonukleotidy ve slabém pufru, jako je TE (10 mM Tris, pH 7,5-8,0, 1 mM EDTA). V aplikacích, kde TE není vhodný, lze použít sterilní vodu bez nukleáz. Vysoce kvalitní voda však může být mírně kyselá a nedoporučuje se pro dlouhodobé skladování oligonukleotidů.

Zásobní roztok 100 μM lze získat podle následujícího návodu: Vezměte počet nanomolů (nmol), který je uveden na štítku zkumavky a/nebo v dokumentu o zajištění kvality dodaném s oligem, a vynásobte jej deseti. Výsledek udává počet mikrolitrů kapaliny, kterou je třeba přidat do zkumavky, aby bylo dosaženo konečné koncentrace 100 μM. Pokud je například výtěžnost oliga 43,5 nmol, objem, který je třeba přidat pro získání 100 μM zásoby, je 435 μl. Všimněte si, že to odpovídá zásobnímu roztoku 100 pmol/μl. Zásobní roztok lze pak podle potřeby dále ředit na základě požadavků aplikace. Pro PCR se obvykle používá pracovní koncentrace 10 μM nebo 20 μM. Zásobní roztok skladujte v alikvotech při -20 °C a vyhněte se opakovaným cyklům zmrazování a rozmrazování.

Odkazy

1. Little S. 1995. Amplification?Refractory Mutation System ( ARMS ) Analysis of Point Mutations. Current Protocols in Human Genetics. 7(1): https://doi.org/10.1002/0471142905.hg0908s07

2. Ferrie RM, Schwarz MJ, Robertson NH, Vaudin S, Super M, Malone G, Little S. 1992. Development, multiplexing, and application of ARMS tests for common mutations in the CFTR gene. Am J Hum Genet.. 51(2):251–262.

3. Liu J, Huang S, Sun M, Liu S, Liu Y, Wang W, Zhang X, Wang H, Hua W. 2012. An improved allele-specific PCR primer design method for SNP marker analysis and its application. Plant Methods. 8(1):34. https://doi.org/10.1186/1746-4811-8-34

4. Vestheim H, Jarman SN. 2008. Blocking primers to enhance PCR amplification of rare sequences in mixed samples ? a case study on prey DNA in Antarctic krill stomachs. Front Zool. 5(1):12. https://doi.org/10.1186/1742-9994-5-12

5. Taft RJ, Pheasant M, Mattick JS. 2007. The relationship between non-protein-coding DNA and eukaryotic complexity. Bioessays. 29(3):288-299. https://doi.org/10.1002/bies.20544

6. Taft RJ, Pang KC, Mercer TR, Dinger M, Mattick JS. 2010. Non-coding RNAs: regulators of disease. J. Pathol.. 220(2):126-139. https://doi.org/10.1002/path.2638

7. Beck D, Ayers S, Wen J, Brandl MB, Pham TD, Webb P, Chang C, Zhou X. 2011. Integrative analysis of next generation sequencing for small non-coding RNAs and transcriptional regulation in Myelodysplastic Syndromes. BMC Med Genomics. 4(1): https://doi.org/10.1186/1755-8794-4-19

8. Ponjavic J, Oliver PL, Lunter G, Ponting CP. Genomic and Transcriptional Co-Localization of Protein-Coding and Long Non-Coding RNA Pairs in the Developing Brain. PLoS Genet. 5(8):e1000617. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000617

9. Ponting CP, Oliver PL, Reik W. 2009. Evolution and Functions of Long Noncoding RNAs. Cell. 136(4):629-641. https://doi.org/10.1016/j.cell.2009.02.006

10. 2005. The Transcriptional Landscape of the Mammalian Genome. Science. 309(5740):1559-1563. https://doi.org/10.1126/science.1112014

11. ROZOWSKY J, WU J, LIAN Z, NAGALAKSHMI U, KORBEL J, KAPRANOV P, ZHENG D, DYKE S, NEWBURGER P, MILLER P, et al. 2006. Novel Transcribed Regions in the Human Genome. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 71(0):111-116. https://doi.org/10.1101/sqb.2006.71.054

12. Kapranov P, Cheng J, Dike S, Nix DA, Duttagupta R, Willingham AT, Stadler PF, Hertel J, Hackermuller J, Hofacker IL, et al. 2007. RNA Maps Reveal New RNA Classes and a Possible Function for Pervasive Transcription. Science. 316(5830):1484-1488. https://doi.org/10.1126/science.1138341

13. Kato M, Slack FJ. 2008. microRNAs: small molecules with big roles -C. elegans to human cancer. 100(2):71-81. https://doi.org/10.1042/bc20070078

14. Tijsterman M, Plasterk RH. 2004. Dicers at RISC. Cell. 117(1):1-3. https://doi.org/10.1016/s0092-8674(04)00293-4

15. Benes V, Castoldi M. 2010. Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available. Methods. 50(4):244-249. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2010.01.026

16. Nolan T, Bustin SA. 2013. PCR Technology: Current Innovations. 3. CRC Press:

17. Shi R, Chiang VL. 2005. Facile means for quantifying microRNA expression by real-time PCR. BioTechniques. 39(4):519-525. https://doi.org/10.2144/000112010

18. Balcells I, Cirera S, Busk PK. 2011. Specific and sensitive quantitative RT-PCR of miRNAs with DNA primers. BMC Biotechnology. 11(1):70. https://doi.org/10.1186/1472-6750-11-70

19. Heath A, Deluge N, de Amorim M, Dias-Neto E. 2013. Development and Use of qPCR Assays for Detection and Study of Neglected Tropical and Emerging Infectious Diseases.209-220. https://doi.org/10.1201/b14930-19

20. Tyagi S, Kramer FR. 1996. Molecular Beacons: Probes that Fluoresce upon Hybridization. Nat Biotechnol. 14(3):303-308. https://doi.org/10.1038/nbt0396-303

21. Thelwell N. 2000. Mode of action and application of Scorpion primers to mutation detection. 28(19):3752-3761. https://doi.org/10.1093/nar/28.19.3752

22. Petersen M, Wengel J. 2003. LNA: a versatile tool for therapeutics and genomics. Trends in Biotechnology. 21(2):74-81. https://doi.org/10.1016/s0167-7799(02)00038-0

23. Nolan T, Hands RE, Ogunkolade W, Bustin SA. 2006. SPUD: A quantitative PCR assay for the detection of inhibitors in nucleic acid preparations. Analytical Biochemistry. 351(2):308-310. https://doi.org/10.1016/j.ab.2006.01.051