Přejít k obsahu
Merck
DomůPurifikace DNA a RNAProteináza K: Úvod a aplikace

Proteináza K: Úvod a aplikace


3D pásková struktura proteinázy K znázorňující alfa šroubovice zeleně, beta listy fialově a další úseky aa modře.

Co je proteináza K?

Proteináza K je serinová proteáza, která rozkládá bílkoviny hydrolyzací peptidových vazeb. Jedná se o širokospektrou proteázu, která dokáže štěpit širokou škálu proteinů, včetně těch, které jsou vůči jiným proteázám rezistentní.

Proteináza K se běžně používá v molekulární biologii a biochemii k štěpení strukturních proteinů a enzymů. Je užitečná při odstraňování nukleáz, které mohou degradovat DNA a RNA, a také při izolaci neporušené genomové DNA z různých zdrojů. Proteináza K se také používá při analýze struktury a funkce prionových proteinů (Cronier et al. 2008).

Proteináza K je stabilní v širokém rozmezí pH, teploty a odolává mnoha detergentům a denaturačním činidlům. Díky tomu je účinná pro přípravu vzorků v různých výzkumných a diagnostických aplikacích.

Proteináza K se běžně používá k izolaci DNA nebo RNA při výzkumu v molekulární biologii tím, že rozkládá nežádoucí proteiny ve vzorku, jako jsou nukleázy, RNázy a DNázy. Proteináza K se také používá v procesu extrakce nukleových kyselin k rozkladu bílkovinné složky buněčné membrány a umožnění přístupu k DNA a RNA. Je účinná při štěpení mnoha typů proteinů, včetně těch, které jsou rezistentní vůči jiným typům proteáz, jako je trypsin.

Kromě výzkumu v molekulární biologii se proteináza K používá v široké škále dalších aplikací, včetně farmaceutické výroby a diagnostických aplikací. Ve farmaceutickém průmyslu ji lze použít k odstranění nežádoucích proteinů v jejich výrobním procesu.  V diagnostice se používá při izolaci DNA a RNA z klinických vzorků pro následnou analýzu.  

Proteináza K se používá při extrakci DNA a RNA, protože se jedná o proteolytický enzym, který dokáže rozkládat bílkoviny včetně těch, které jsou přítomny v buněčné membráně a jádře. Při použití proteinázy K k extrakci DNA a RNA se obvykle přidává do lyzačního pufru, který obsahuje detergenty a soli, které pomáhají narušit buněčnou membránu a uvolnit nukleové kyseliny do roztoku. Proteináza K pak tráví bílkoviny v lyzovaném vzorku, včetně histonů a dalších chromozomálních bílkovin, které by jinak mohly interferovat s navazujícími aplikacemi, jako jsouPCR, RT-PCR, Sangerovo sekvenování, sekvenování nové generace (NGS), fluorescenční in situ hybridizace (FISH) a další aplikace molekulárně biologického výzkumu a diagnostiky. Použití proteinázy K při extrakci DNA a RNA pomáhá zajistit čistotu a integritu vzorku.

Proteináza K se obvykle nepoužívá přímo v polymerázové řetězové reakci (PCR), ale používá se v kroku extrakce DNA před PCR, aby se zlepšila kvalita vzorku DNA. 

Proteináza K je účinná při rozkladu široké škály proteinů, včetně těch, které jsou odolné vůči jiným typům proteáz, jako je trypsin. Odstraněním proteinových kontaminantů ze vzorku DNA před PCR lze zvýšit účinnost a přesnost reakce, což vede ke spolehlivějším výsledkům. Kromě toho může použití proteinázy K při extrakci DNA pomoci snížit riziko falešně negativních výsledků nebo jiných chyb při diagnostickém testování, kde jsou přesné a spolehlivé výsledky velmi důležité.

Při PCR se templát DNA amplifikuje prostřednictvím řady cyklů denaturace, žíhání a extenze. Jakékoli nečistoty ve vzorku DNA, například proteiny, mohou tento proces narušit tím, že inhibují aktivitu enzymu polymerázy nebo narušují vazbu primerů na templát.

Proteináza K je serinová proteáza, která štěpí peptidové vazby v bílkovinách. Její mechanismus účinku zahrnuje několik kroků:

  1.  Vazba: Proteináza K se nejprve váže na protein nebo substrát nukleové kyseliny prostřednictvím nespecifických hydrofobních interakcí.
  2. Aktivace: Po navázání prochází enzym aktivačním krokem, při kterém je katalytický serinový zbytek aktivován histidinovým zbytkem a molekulou vody. To vede k vytvoření aktivního místa, které může štěpit peptidové vazby.
  3. Štěpení: Aktivní místo proteinázy K štěpí peptidovou vazbu na straně karboxylové kyseliny aminokyselinových zbytků, které obsahují aromatické, alifatické nebo hydrofobní aminokyselinové zbytky. Enzym může také štěpit peptidové vazby na amidové straně glycinových zbytků.
  4. Uvolňování produktů: Po štěpení se produkty reakce (tj, peptidy) se z enzymu uvolňují.

Mechanismus účinku proteinázy K je podobný jako u jiných serinových proteáz, ale vyznačuje se schopností fungovat za nepříznivých podmínek, jako jsou vysoké teploty a přítomnost detergentů.

Proteázy a proteináza K jsou proteázy, které se v některých důležitých ohledech liší. Proteázy jsou třída enzymů, které štěpí peptidové vazby v bílkovinách. Existuje mnoho různých typů proteáz, mimo jiné serinové proteázy, cysteinové proteázy a metaloproteázy. Tyto enzymy se podílejí na mnoha biologických procesech, včetně rozkladu bílkovin, srážení krve a trávení. Proteináza K je specifický typ serinové proteázy, která se široce používá k trávení proteinů a odhalování nukleových kyselin izolovaných z buněk nebo tkání.

Metoda extrakce DNA proteinázou K se běžně používá k izolaci vysoce kvalitní DNA pro následné aplikace, jako je PCR, sekvenování a klonování. Metoda je obzvláště užitečná pro vzorky, které obsahují velké množství proteinů, jako jsou tkáně nebo buňky, protože umožňuje účinné odstranění proteinů bez poškození DNA. Metoda extrakce DNA proteinázou K obvykle zahrnuje následující kroky:

  1. Lýza vzorku:Lyzují se buňky nebo tkáně a uvolňuje se genomová DNA přidáním lyzačního pufru ke vzorku, který obsahuje detergenty a další činidla, jež narušují buněčnou membránu a rozkládají proteinové komplexy.
  2. Rozklad bílkovin:Přidejte ke vzorku proteinázu K, abyste rozštěpili bílkoviny, které jsou navázány na DNA. Enzym se obvykle přidává ke vzorku v konečné koncentraci 0,2-1 mg/ml a inkubuje se při optimální teplotě (55-65 °C) po dobu 30-60 minut.
  3. Deaktivace: Po dokončení štěpení proteinů se proteináza K deaktivuje zahřátím vzorku na teplotu vyšší než
    95 °C po dobu několika minut nebo přidáním inhibitoru proteázy ke vzorku.
  4. Izolace DNA:DNA může být poté ze vzorku izolována různými metodami, například srážením ethanolem nebo isopropanolem nebo použitím komerční soupravy pro izolaci DNA
.
SARS-CoV-2 virus particle artist drawing

Proteináza K není přímo testována na přítomnost viru SARS-CoV-2, ale používá se v předcházejícím kroku extrakce RNA v diagnostickém procesu COVID-19.

Virus obsahuje genetický materiál ve formě RNA. Pro zjištění přítomnosti viru test zahrnuje nejprve extrakci RNA ze vzorku pacienta, například z nosního výtěru, a poté použití RT-PCR (reverzní transkripční polymerázová řetězová reakce) k amplifikaci a detekci specifických sekvencí virové RNA. V procesu extrakce RNA lze použít proteinázu K, která tráví a inaktivuje RNázy, čímž chrání RNA, eliminuje falešně negativní výsledky a zvyšuje přesnost diagnostického testu COVID-19.

Pro vaše konkrétní aplikace jsou k dispozici velkoobjemová balení a vlastní velikosti balení proteinázy K. Vyplňte formulář a získejte více informací o naší nabídce. 

VÍCE INFORMACÍ

Materiály
Loading

Odkazy

1.
Cronier S, Gros N, Tattum M, Jackson G, Clarke A, Collinge J, Wadsworth J. 2008. Detection and characterization of proteinase K-sensitive disease-related prion protein with thermolysin. 416(2):297-305. https://doi.org/10.1042/bj20081235
2.
Ñique AM, Coronado-Marquina F, Mendez Rico JA, García Mendoza MP, Rojas-Serrano N, Simas PVM, Cabezas Sanchez C, Drexler JF. A faster and less costly alternative for RNA extraction of SARS-CoV-2 using proteinase k treatment followed by thermal shock. PLoS ONE. 16(3):e0248885. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0248885
3.
Sinha MK, Songer T, Xiao Q, Sloan JH, Wang J, Ji S, Alborn WE, Davis RA, Swarbrick MM, Stanhope KL, et al. 2007. Analytical Validation and Biological Evaluation of a High–Molecular-Weight Adiponectin ELISA. 53(12):2144-2151. https://doi.org/10.1373/clinchem.2007.090670
4.
Marzinotto S, Mio C, Cifù A, Verardo R, Pipan C, Schneider C, Curcio F. A streamlined approach to rapidly detect SARS-CoV-2 infection, avoiding RNA purification. https://doi.org/10.1101/2020.04.06.20054114
5.
Samal BB, Karan B, Parker C, Stabinsky Y. 1991. Isolation and thermal stability studies of two novel serine proteinases from the fungus Tritirachium album Limber. Enzyme and Microbial Technology. 13(1):66-70. https://doi.org/10.1016/0141-0229(91)90190-l
6.
KRAUS E, FEMFERT U. 1976. Proteinase K from the MoldTritirachium albumLimber. Specificity and Mode of Action. Hoppe-Seyler´s Zeitschrift für physiologische Chemie. 357(2):937-948. https://doi.org/10.1515/bchm2.1976.357.2.937
Chcete-li pokračovat, musíte se přihlásit.

Abyste mohli pokračovat ve čtení, přihlaste se nebo vytvořte účet.

Nemáte účet?