Proteináza K: Úvod a aplikace
Co je proteináza K?
Proteináza K je serinová proteáza, která rozkládá bílkoviny hydrolyzací peptidových vazeb. Jedná se o širokospektrou proteázu, která dokáže štěpit širokou škálu proteinů, včetně těch, které jsou vůči jiným proteázám rezistentní.
Proteináza K se běžně používá v molekulární biologii a biochemii k štěpení strukturních proteinů a enzymů. Je užitečná při odstraňování nukleáz, které mohou degradovat DNA a RNA, a také při izolaci neporušené genomové DNA z různých zdrojů. Proteináza K se také používá při analýze struktury a funkce prionových proteinů (Cronier et al. 2008).
Proteináza K je stabilní v širokém rozmezí pH, teploty a odolává mnoha detergentům a denaturačním činidlům. Díky tomu je účinná pro přípravu vzorků v různých výzkumných a diagnostických aplikacích.
K čemu se proteináza K používá?
Proteináza K se běžně používá k izolaci DNA nebo RNA při výzkumu v molekulární biologii tím, že rozkládá nežádoucí proteiny ve vzorku, jako jsou nukleázy, RNázy a DNázy. Proteináza K se také používá v procesu extrakce nukleových kyselin k rozkladu bílkovinné složky buněčné membrány a umožnění přístupu k DNA a RNA. Je účinná při štěpení mnoha typů proteinů, včetně těch, které jsou rezistentní vůči jiným typům proteáz, jako je trypsin.
Kromě výzkumu v molekulární biologii se proteináza K používá v široké škále dalších aplikací, včetně farmaceutické výroby a diagnostických aplikací. Ve farmaceutickém průmyslu ji lze použít k odstranění nežádoucích proteinů v jejich výrobním procesu. V diagnostice se používá při izolaci DNA a RNA z klinických vzorků pro následnou analýzu.
Proč se při extrakci DNA a RNA používá proteináza K?
Proteináza K se používá při extrakci DNA a RNA, protože se jedná o proteolytický enzym, který dokáže rozkládat bílkoviny včetně těch, které jsou přítomny v buněčné membráně a jádře. Při použití proteinázy K k extrakci DNA a RNA se obvykle přidává do lyzačního pufru, který obsahuje detergenty a soli, které pomáhají narušit buněčnou membránu a uvolnit nukleové kyseliny do roztoku. Proteináza K pak tráví bílkoviny v lyzovaném vzorku, včetně histonů a dalších chromozomálních bílkovin, které by jinak mohly interferovat s navazujícími aplikacemi, jako jsouPCR, RT-PCR, Sangerovo sekvenování, sekvenování nové generace (NGS), fluorescenční in situ hybridizace (FISH) a další aplikace molekulárně biologického výzkumu a diagnostiky. Použití proteinázy K při extrakci DNA a RNA pomáhá zajistit čistotu a integritu vzorku.
Proč se při PCR používá proteináza K?
Proteináza K se obvykle nepoužívá přímo v polymerázové řetězové reakci (PCR), ale používá se v kroku extrakce DNA před PCR, aby se zlepšila kvalita vzorku DNA.
Proteináza K je účinná při rozkladu široké škály proteinů, včetně těch, které jsou odolné vůči jiným typům proteáz, jako je trypsin. Odstraněním proteinových kontaminantů ze vzorku DNA před PCR lze zvýšit účinnost a přesnost reakce, což vede ke spolehlivějším výsledkům. Kromě toho může použití proteinázy K při extrakci DNA pomoci snížit riziko falešně negativních výsledků nebo jiných chyb při diagnostickém testování, kde jsou přesné a spolehlivé výsledky velmi důležité.
Při PCR se templát DNA amplifikuje prostřednictvím řady cyklů denaturace, žíhání a extenze. Jakékoli nečistoty ve vzorku DNA, například proteiny, mohou tento proces narušit tím, že inhibují aktivitu enzymu polymerázy nebo narušují vazbu primerů na templát.
Jaký je mechanismus účinku proteinázy K?
Proteináza K je serinová proteáza, která štěpí peptidové vazby v bílkovinách. Její mechanismus účinku zahrnuje několik kroků:
- Vazba: Proteináza K se nejprve váže na protein nebo substrát nukleové kyseliny prostřednictvím nespecifických hydrofobních interakcí.
- Aktivace: Po navázání prochází enzym aktivačním krokem, při kterém je katalytický serinový zbytek aktivován histidinovým zbytkem a molekulou vody. To vede k vytvoření aktivního místa, které může štěpit peptidové vazby.
- Štěpení: Aktivní místo proteinázy K štěpí peptidovou vazbu na straně karboxylové kyseliny aminokyselinových zbytků, které obsahují aromatické, alifatické nebo hydrofobní aminokyselinové zbytky. Enzym může také štěpit peptidové vazby na amidové straně glycinových zbytků.
- Uvolňování produktů: Po štěpení se produkty reakce (tj, peptidy) se z enzymu uvolňují.
Mechanismus účinku proteinázy K je podobný jako u jiných serinových proteáz, ale vyznačuje se schopností fungovat za nepříznivých podmínek, jako jsou vysoké teploty a přítomnost detergentů.
Jaký je rozdíl mezi proteázou a proteinázou K?
Proteázy a proteináza K jsou proteázy, které se v některých důležitých ohledech liší. Proteázy jsou třída enzymů, které štěpí peptidové vazby v bílkovinách. Existuje mnoho různých typů proteáz, mimo jiné serinové proteázy, cysteinové proteázy a metaloproteázy. Tyto enzymy se podílejí na mnoha biologických procesech, včetně rozkladu bílkovin, srážení krve a trávení. Proteináza K je specifický typ serinové proteázy, která se široce používá k trávení proteinů a odhalování nukleových kyselin izolovaných z buněk nebo tkání.
Jaká je metoda extrakce DNA proteinázou K?
Metoda extrakce DNA proteinázou K se běžně používá k izolaci vysoce kvalitní DNA pro následné aplikace, jako je PCR, sekvenování a klonování. Metoda je obzvláště užitečná pro vzorky, které obsahují velké množství proteinů, jako jsou tkáně nebo buňky, protože umožňuje účinné odstranění proteinů bez poškození DNA. Metoda extrakce DNA proteinázou K obvykle zahrnuje následující kroky:
- Lýza vzorku:Lyzují se buňky nebo tkáně a uvolňuje se genomová DNA přidáním lyzačního pufru ke vzorku, který obsahuje detergenty a další činidla, jež narušují buněčnou membránu a rozkládají proteinové komplexy.
- Rozklad bílkovin:Přidejte ke vzorku proteinázu K, abyste rozštěpili bílkoviny, které jsou navázány na DNA. Enzym se obvykle přidává ke vzorku v konečné koncentraci 0,2-1 mg/ml a inkubuje se při optimální teplotě (55-65 °C) po dobu 30-60 minut.
- Deaktivace: Po dokončení štěpení proteinů se proteináza K deaktivuje zahřátím vzorku na teplotu vyšší než
95 °C po dobu několika minut nebo přidáním inhibitoru proteázy ke vzorku. - Izolace DNA:DNA může být poté ze vzorku izolována různými metodami, například srážením ethanolem nebo isopropanolem nebo použitím komerční soupravy pro izolaci DNA
Jaká je úloha proteinázy K při testování kovidů?
Proteináza K není přímo testována na přítomnost viru SARS-CoV-2, ale používá se v předcházejícím kroku extrakce RNA v diagnostickém procesu COVID-19.
Virus obsahuje genetický materiál ve formě RNA. Pro zjištění přítomnosti viru test zahrnuje nejprve extrakci RNA ze vzorku pacienta, například z nosního výtěru, a poté použití RT-PCR (reverzní transkripční polymerázová řetězová reakce) k amplifikaci a detekci specifických sekvencí virové RNA. V procesu extrakce RNA lze použít proteinázu K, která tráví a inaktivuje RNázy, čímž chrání RNA, eliminuje falešně negativní výsledky a zvyšuje přesnost diagnostického testu COVID-19.
Hromadné objednávky Proteinázy K
Pro vaše konkrétní aplikace jsou k dispozici velkoobjemová balení a vlastní velikosti balení proteinázy K. Vyplňte formulář a získejte více informací o naší nabídce.
Odkazy
Abyste mohli pokračovat ve čtení, přihlaste se nebo vytvořte účet.
Nemáte účet?