Hogyan válasszunk másodlagos antitestet

Az alábbi információk segítenek eldönteni, hogy melyik másodlagos ellenanyag lehet a legjobb az adott alkalmazáshoz.

Kérdések

1. Melyik fajban fejlesztették ki az elsődleges ellenanyagot?
2. Milyen osztályba (izotípusba) és/vagy alosztályba tartozik az elsődleges antitest?
3. Affinitással tisztított antitestet vagy IgG frakciót használjak?
4. Milyen címkét válasszak?
5. Mikor használjak előadszorbeált másodlagos ellenanyagot?
6. Mikor van szükség F(ab) vagy F(ab')₂ fragmentum antitestre?
7. Hogyan lehet megfejteni a másodlagos antitestek nomenklatúráját?

Melyik fajra fejlesztették ki az elsődleges antitestet?

A másodlagos antitestek az elsődleges antitest fajával szemben irányulnak. Ezért olyan másodlagos ellenanyagra lesz szüksége, amelyet az elsődleges ellenanyag gazdafajától eltérő fajban tenyésztettek ki. Például, ha az elsődleges antitestet egérben tenyésztették ki, akkor egy kecskében, nyúlban stb. tenyésztett egér-ellenes másodlagos antitestre lesz szüksége.

Milyen osztályba (izotípusba) és/vagy alosztályba tartozik az elsődleges antitest?

Ez a kérdés elsősorban akkor fontos, ha monoklonális antitestekkel dolgozunk. A poliklonális antitestek azonban jellemzően IgG osztályú immunglobulinok. Emiatt a másodlagos antitestek elsősorban anti-IgG antitestek lesznek.

A monoklonális antitesteket leggyakrabban egerekben, esetenként patkányokban, hörcsögökben vagy nyulakban fejlesztik ki. Ha például az elsődleges monoklonális antitest egér IgM, akkor olyan másodlagos antitestet szeretnénk, amely reagál az egér IgM-mel (anti-Eger IgM).

Ha az elsődleges monoklonális az egér IgG alosztályok valamelyikébe tartozik, akkor szinte bármilyen anti-Eger IgG másodlagos antitestnek kötődnie kell hozzá. Ha az elsődleges antitest alosztálya nem ismert, akkor anti-Eger IgG F(ab) másodlagos antitestek használhatók, mivel ezek a legtöbb egér immunglobulin alosztályt felismerik.

A humán és egér IgG(s) számos osztálya és alosztálya létezik. A másodlagos kiválasztása nehéz lehet. Az egyik közös tényező azonban ezen IgG(s) között a könnyű láncok (kappa és lambda). Más szóval az IgG, IgM, IgA, IgD és IgE mindegyike rendelkezik kappa vagy lambda könnyűlánccal. A nehézlánc azonban osztályspecifikus.

Immunglobulin osztályok és alosztályok összefoglalása

• Immunglobulin osztályok: IgG, IgM, IgA, IgE, IgD
• Humán immunglobulin alosztályok: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 és IgA2
• Egerek immunglobulin alosztályai: IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3
• Fényes láncok: Kappa, Lambda
• Heavy Chains: IgG (gamma), IgM (mu), IgA (alfa), IgD (delta), IgE (epsilon)

Kiegészítő információk az antitestek reakcióképességéről

• Polivalens: Minden osztállyal reagálnak
• Anti-Fc és nehézlánc-specifikus: csak a nehézláncokkal reagálnak; ezért osztályspecifikusak.
• >Anti-Fab és egész molekula specifikus: nehéz és könnyű láncokkal reagálnak. A könnyűlánc-reaktivitás miatt minden osztállyal képesek reagálni.
• Könnyűlánc (kappa, lambda) specifikus: minden osztállyal reagálnak, mivel minden osztály ugyanazt a kappa vagy lambda könnyűláncot használja.

Affinitással tisztított antitestet vagy IgG frakciót használjak?

A legtöbb ember az affinitással izolált másodlagos antitesteket részesíti előnyben, mert ezek biztosítják a legalacsonyabb mennyiségű nem specifikus kötődést. Bizonyos esetekben azonban IgG-frakciók is szóba jöhetnek, pl. ha az érdeklődésre számot tartó antigén ritka vagy kis mennyiségben van jelen. Ezekben a helyzetekben nagy affinitású antitestekre van szükség. Például az affinitás izolálás során a nagyon nagy affinitású antitestek egy része eltávolításra kerülhet, mert olyan szorosan kötődnek az affinitás mátrixhoz, hogy nem képesek eluálódni.

Milyen címkét válasszak?

A címke nagyon alkalmazásfüggő. Immunoblotting és ELISA esetében az enzimekkel jelölt másodlagos antitestek a legnépszerűbbek. A peroxidáz gazdaságos és általában stabilabb enzim, mint az alkalikus foszfatáz. A kemilumineszcens detektáló rendszerekben való felhasználása is nagyon népszerűvé vált. Az alkalikus foszfatázt viszont érzékenyebbnek tartják, mint a peroxidázt, különösen, ha kolorimetrikus detektálást alkalmaznak.

A sejtek vagy szövetek festésére alkalikus foszfatáz, peroxidáz vagy fluorokrómhoz konjugált másodlagos antitestek használhatók. Gyakori fluorokrómok a FITC, a phycoerythrin, a CF™ festékek, az Atto festékek és a Quantum Red. A kapcsolódó alkalmazások az immuncitokémia/immunfluoreszcencia, az áramlási citometria vagy az immunhisztokémia.

A fokozott amplifikáció létrehozásához kétlépéses biotin/avidin rendszer használható. A biotin nagyon nagy affinitással kötődik az avidinhez, ami lényegében irreverzibilis kölcsönhatást eredményez. Először egy biotinilált másodlagos antitestet alkalmaznak, majd az avidin, ExtrAvidin vagy egy enzimhez vagy fluorokrómhoz konjugált sztreptavidin a biotinilált másodlagos antitest több helyéhez kötődik, így erősítve a jelet, és nagyobb érzékenységet eredményezve, mint amit egy antitest-enzim vagy antitest-fluorokróm konjugátummal önmagában elérhetünk.

Mikor használjak pre-adszorbeált másodlagos antitestet?

A preadszorbeált antitestek használata csökkenti a nem specifikus hátteret, amikor szövetekkel és sejtekkel dolgozik. Az eljárás során a másodlagos ellenanyagot immobilizált szérumfehérjék felett vezetjük át a potenciálisan keresztreaktív fajoktól. Ezért ha emberi szövetekkel dolgozik, válasszon olyan másodlagos ellenanyagot, amelyet emberi szérummal vagy emberi IgG-vel adszorbeáltak.

Mikor van szükség F(ab) vagy F(ab')₂ fragment antitestre?

Ha olyan szövetekkel vagy sejtekkel dolgozunk, amelyek rendelkeznek Fc-receptorokkal, lehetőség szerint F(ab) vagy F(ab')₂ fragmentumot válasszunk a nem specifikus kötődés kiküszöbölése érdekében.  Részletesebben, az F(ab')₂ antitest fragmentumokat olyan vizsgálati rendszerekben használják, ahol az Fc régió jelenléte problémákat okozhat. Az olyan minták, mint a nyirokcsomók, a lép és a perifériás vérkészítmények Fc-receptorokkal rendelkező sejteket tartalmaznak (makrofágok, B-limfociták és természetes ölősejtek), amelyek megköthetik az intakt antitestek Fc-régióját, ami magas háttérfestődést okozhat. Az F(ab')₂ fragmentumok használata biztosítja, hogy a megfigyelt antitest-kötődés nem az Fc-receptoroknak köszönhető.

Hogyan lehet megfejteni a másodlagos ellenanyagok nómenklatúráját?

Anti-Goat IgG (H+L), erősen keresztadszorbeált, CF™. 568 ellenanyag, amelyet szamárból állítottak elő

• Anti-Goat IgG: A faj neve, amely ellen az antitest irányul
• (H + L): A nehéz és könnyű láncokra vonatkozó antitestspecificitás leírása
• Magas keresztfelszívódású: Az antitest számos különböző faj szérumába felszívódott
• CF™ 568 antitest: A detektáló jelölés leírása
• Szamár: A másodlagos antitest gazdafaja