Félszáraz vagy tartályos elektrotranszfer hibaelhárítás

Az elektrotranszfer a fehérjék poliakrilamid gélről (SDS-PAGE) egy Immobilon^® PVDF transzfer membránra történő átvitelének standard eljárására utal. A két általánosan használt elektrotranszfer technika a tartályos transzfer és a félszáraz transzfer. Mindkettő ugyanazon az elven alapul, és csak a gél/membrán köteg tartására használt mechanikai eszközökben és az elektromos mező alkalmazásában különböznek.

Kattintson a félszáraz vagy a tartályos elektrotranszfer tüneteire, ha olvasni szeretne a lehetséges okokról és azok orvoslásáról:

• Band Smeared/Distorted
  
• Magas háttér a fluoreszcens detektálásban
  
• Nincs jel
  
• Kismolekulatömegű fehérjék rossz átvitele
  
• Kismolekulatömegű fehérjék rossz átvitele
  
• Nagy molekulatömegű fehérjék gyenge átvitele (~ & >80 kDa)
  
• Pozitívan töltött fehérjék gyenge átvitele
  
• Pozitívan töltött fehérjék gyenge átvitele
/a>

• Poor Semi-dry-transzfer
  
• Széles fehérjeméret-tartomány gyenge átvitele
  

Band Smeared/Distorted

Elképzelhető ok	Megoldás
A membránt nem egyenletesen nedvesítették meg metanollal	A teljes membránt előzetesen meg kell nedvesíteni metanollal; a teljes membránnak egyenletesen kell átlátszatlanból félig átlátszóvá válnia.
Légbuborékok a membrán alatt és a köteg más rétegei között . A gél és a membrán közötti légbuborékok hatása a Western blot transzfer lépés során<	Egy pipetta vagy keverőpálca segítségével óvatosan görgesse ki a csapdába esett légbuborékokat a köteg összeállítása közben.
Egyenetlen érintkezés a gél és a membrán között	Győződjön meg arról, hogy a gél és a membrán teljes felülete jól érintkezik.
Túl sok hő keletkezik az átvitel során	A futtatás hőmérséklete nem haladhatja meg a 20 °C-ot. Tartályos transzfer esetén előhűtjük a puffert, vagy hideg helyiségben végezzük el a transzfert. Félszáraz transzfer esetén vagy rövidítse le a futási időt, növelje a szűrőpapírok számát, vagy csökkentse az áramot.
A félszáraz transzfer során kiszáradt szűrőpapír< /td>	Győződjön meg róla, hogy a szűrőpapír alaposan átázott az átvitel előtt, vagy használjon további lapokat. Ügyeljen arra, hogy a köteg összeszerelése kevesebb mint 15 perc alatt megtörténjen.
Túl gyorsan átvitt fehérjék; Fehérjék felhalmozódása a membrán felületén	Csökkentse az elektromos mező erősségét.

magas háttér a fluoreszcens detektálásban

Possible Cause	Megoldás
Autofluoreszcencia a transzfer membránról	A transzferhez alacsony autofluoreszcenciájú membránt, például Immobilon®-FL membránt használjon. Fordított kép, amely a transzferrin fluoreszcens kimutatását mutatja be humán szérumban különböző Western blot transzfereken
A membránon áthaladó fehérjék	A feszültség akár 50%-os csökkentésével növeljük a fehérjéknek a membránnal való kölcsönhatáshoz szükséges időt. A magas negatív töltésű fehérjék (magas aszparaginsav- és glutaminsavtartalmuk miatt) hajlamosak nagyon gyorsan mozogni az elektromos térben. Csökkentse a feszültséget, hogy lelassítsa ezeknek a fehérjéknek a vándorlását. A gélben lévő SDS gátolhatja a fehérjék kötődését. Equilibrálja a gélt a transzferpufferben legalább 15 percig A gél (fent) és a blot (lent) azt mutatja, hogy az equilibration javítja a transzfer hatékonyságát a Western blot esetében. A metanol koncentrációja a transzferpufferben túl alacsony az SDS eltávolításának megkönnyítéséhez. Növelje a metanolt 15-20%-ra, különösen a kisebb molekulatömegű fehérjék esetében. A membránt metanollal kell előnedvesíteni; a teljes membránnak egyenletesen kell átlátszatlanból félig átlátszóvá válnia. Váltás Immobilon®-PSQ transzfer membránra.
A gélben megtartott fehérjék	Ha a transzferpufferben a metanol koncentrációja túl magas, az eltávolíthatja az SDS-t a fehérjékről, és a gélben fehérje kicsapódáshoz vezethet. Ez csökkentené a nagy molekulatömegű fehérjék gélből történő transzfert. Ha a fehérjék kicsapódása problémát jelent, a transzferpuffer kiegészíthető SDS-szel (0,01% - 0,05%) az oldhatóság elősegítése érdekében. Ezenkívül a felesleges metanol hajlamos lehet a gél zsugorodására vagy összehúzódására, ami gátolja a nagy molekulatömegű fehérjék átvitelét.
A fehérje izoelektromos pontja a transzferpuffer pH-ján vagy annak közelében van	Az a fehérje, amelynek izoelektromos pontja megegyezik a transzferpuffer pH-jával, nem rendelkezik nettó töltéssel, és így elektromos térben nem vándorol. Az átvitel megkönnyítése érdekében próbáljon ki egy magasabb pH-jú puffert, például 10 mM CAPS puffert pH 11-en, amely 10% metanolt tartalmaz, vagy egy alacsonyabb pH-jú puffert, például ecetsav puffert.
Gyenge detektálás, ha karbamidot használunk a gélben és/vagy az átviteli pufferben<	Csökkentse a hőmérsékletet keringtető pufferbeállítás használatával, vagy futtassa a transzfert hideg helyiségben. A karbamid hő jelenlétében a fehérjék karbamilációját okozhatja, ami megváltoztathatja a fehérjében lévő aminosavak töltését. Ez befolyásolhatja az antitestek felismeréséhez és kötődéséhez nélkülözhetetlen epitópokat.
A fehérjék nem teljes átvitele	A gélt ellenőrizze a fehérjemaradványok kimutatására. Ha a transzfer nem volt teljes, vizsgálja felül a transzfer technikáját.
Gyenge fehérjeretenció	Amikor a transzfer befejeződött, győződjön meg róla, hogy a membránt teljesen megszárította, hogy a fehérjék optimális kötődését és rögzülését elérje. Ezt bármely downstream detektálási módszer előtt el kell végezni.

No Signal

Lehetséges ok	Elhárítás
	Nincs fehérjeátvitel	A transzfer során ellenőrizze a gél és a membrán orientációját. Használjon előre megfestett molekulatömeg-standardokat a transzfer ellenőrzéséhez.

A kis molekulatömegű fehérjék gyenge átvitele

Possible Ok	Elhárítás
Elégtelen fehérjeretenció Az SDS zavarja a kis molekulasúlyú fehérjék kötődését	Váltás Immobilon®-PSQ transzfer membránra. Vegye ki az SDS-t a transzferoldatból.
Alacsony metanol-koncentráció a transzferpufferben/td>	Magasabb metanolszázalékot (15-20 %) használjon a transzferpufferben.
Elégtelen fehérje kötési idő	Alacsonyabb feszültség optimalizálhatja a kis fehérjék membránhoz való kötődését.
Az áram nem halad át a membránon<./td>	A membránt és a blottingpapírt pontosan a gél méretére vágja; ne engedjen túlnyúlásokat. Feldolgozhat előre vágott membrán és szűrőpapír szendvicseket

Nagy molekulatömegű fehérjék (~ >80 kDa)

rossz átvitele

Pozitív Ok .nbsp;                                     nbsp;	Elhárítás
A metanol koncentrációja túl magas	A metanol koncentrációjának 10%-ra (v/v) vagy kevesebbre csökkentése segíthet a nagy molekulatömegű fehérjék átvitelében, mivel lehetővé teszi a gél duzzadását. Ezenkívül az alacsonyabb metanolszázalék csökkentheti a fehérjék SDS-veszteségét és a fehérjék kicsapódását a gélben. A <200 kDa fehérjék nem olyan érzékenyek a membránhoz való kötődésben az SDS zavarására, mint a <100 kDa fehérjék.

Pozitívan töltött fehérjék gyenge átvitele

Lehetséges ok	Elhárítás
A fehérjék nettó töltése a transzferpufferben pozitív; a fehérjék a katód felé mozognak.	Fordítsa meg a transzferköteget úgy, hogy az Immobilon® transzfer membrán a gél katódoldalán legyen.

Poor Semi-Dry Transfer

lehetséges ok	megoldás
Az áram megkerüli a gélköteget	Győződjön meg róla, hogy a membrán és a blotting papír pontosan a gél méretére van vágva, és nincsenek túlnyúlások. Vizsgálja meg az előre levágott membrán és szűrőpapír szendvicseket

Széles fehérjetartomány gyenge transzfere

Possible Ok	Elhárítás
A nagy és kis fehérjék átviteléhez szükséges eltérő feltételek	Hivatkozás: "A fehérjék széles MW-tartományának átvitele többlépcsős átvitelt igényelhet" (T. Otter et al, Anal. Biochem. 162:370-377 (1987). Három pufferes rendszert használjon félszáraz transzferhez (Tekintse meg a protokollt a 36. oldalon a Protein Blotting Handbook (PDF).)