Immunprecipitáció Western Blot analízise (IP-Western)

Az IP-Western-analízis továbbra is népszerű módszer a fehérje-fehérje kölcsönhatások azonosítására és a több fehérje komplexben lévő ismeretlen fehérjék azonosítására. A lépések közé tartozik a sejtlízis, az antitest-antigén (immun)komplex képzése, az immunkomplexek kicsapása és a Western blottinggal történő elemzés.

Bővebben

• High Background
• Nem eluálódott célfehérje vagy nem eluálódott elegendő célfehérje
• Extrasáv(ok) 50 kDa és 20 kDa értéken a végleges Western Bloton, amelyek elfedhetik az érdekes sávot
• Útmutató az immunprecipitációs gyöngyök kiválasztásához

Magas háttér

1. ábra. Magas háttér, ami nem specifikus sávokat eredményez a Western bloton.

Possible Cause	Segítség
Nem specifikus kötődés a gyöngyökhöz	Agarózgyöngyök használata esetén végezzen előtisztítási lépést. A nem bevont agarózgyöngyök hozzáadása (az antitesttel bevont gyöngyök hozzáadása előtt) a fehérjekeverékhez eltávolítja azokat a fehérjéket, amelyek nem specifikusan kötődnek az agarózhoz. Győződjön meg arról, hogy a gyöngyöket megfelelően blokkolja BSA-val az antitest hozzáadása előtt. Csökkentse a gyöngyök térfogatát.
A mosópuffer nem elég szigorú	Váltás nagyobb szigorúságú pufferre, például RIPA alapú pufferre.
Nem specifikus antitestkötés	Növelje az inkubációs időt, a lizátum térfogatát/koncentrációját és/vagy az antitest koncentrációját. Specifikusabb antitestet használjon.
Nem megfelelő mosás	Adjon több mosást és/vagy mosson hosszabb ideig. Növelje a mosópuffer szigorát. A megfelelő mosás biztosítása érdekében fordítsa meg többször a csövet.

Nem eluálódott célfehérje, vagy nem eluálódott elég célfehérje

lehetséges ok	megoldás
Fehérje degradáció, defoszforiláció és denaturáció a lízis lépés során	Minden lépést 4 °C-on végezzen el. Biztosítson megfelelő mennyiségű proteáz- és foszfatáz-inhibitort.
A lízispuffer túlságosan szigorú	Váltás közepes vagy alacsony szigorú pufferre, például NP-40-, Triton® X-100- vagy PBS-alapú pufferre.
< A gyöngyökhöz nem kötött antitest	Győződjön meg arról, hogy a gyöngyök megfelelően illeszkednek az antitest izotípusához.
Nem eléggé kötődik az antitest-antigén	Növelje a lizátumkeverékhez adott ellenanyag koncentrációját és/vagy a gyöngyök koncentrációját. Hosszabb ideig inkubálja az antitest és a lizátum keveréket.  Alacsony fehérjekoncentráció vagy alacsony antitest-fehérje affinitás esetén váltson át a közvetlen immunprecipitációs módszerről közvetett módszerre.
A kicsapási lépés során véletlenül eltávolított agarózgyöngyök< /td>	Vigyázzon, hogy az agarózgyöngyök ne kerüljenek a pipettába. Agarózgyöngyök helyett használjon mágneses gyöngyöket a gyöngyveszteség minimalizálása/megszüntetése érdekében.
Az egér IgG vagy csirke antitest nem kötődik hatékonyan a G- vagy A-protein konjugált gyöngyökhöz (indirekt immunprecipitációhoz)	Adjon hozzá egy hídképző antitestet a kicsapási lépés során, hogy javítsa ezen antitestek kötődését a G-protein- vagy A-protein-konjugált gyöngyökhöz.
A célfehérje a gyöngyökön marad	A megfelelő elúciós puffer típusának és pH-értékének biztosítása.
A fehérjekomplexek megbontása (koimmunoprecipitációs kísérletekben)	Óvatosan forgasson és használjon széles pipettahegyeket a fehérjekomplexek megbontásának elkerülése érdekében.

Extra sáv(ok) 50 kDa és 20 kDa-nál a végleges Western Bloton, amelyek elfedhetik az érdekes sávot

2. ábra. A keresztkötéses IP western során az elsődleges befogadó antitest nehéz és könnyű láncai kikerülnek a mintából.

Possible Cause	Elhárítás
Az elsődleges antitest nehéz és könnyű láncát a másodlagos antitest felismeri./td>	Használjon olyan másodlagos ellenanyagot, amely a natív (nem denaturált) immunglobulinokat detektálja. Keresztkötéses IP-t alkalmazzon, először az A vagy G fehérje gyöngyök DSS segítségével történő keresztkötésével a befogadó antitesthez

Útmutató az immunprecipitációs gyöngyök kiválasztásához

Relatív affinitás

Antitestek	Protein A/G Mix	Protein A	Protein G<	Kappa Ig kötőanyag	Lambda Ig Binder	Kappa/Lambda Mix*
Kullancs IgG	SA	SA	SA	SA
Eger IgM	RE	SA
Egerek IgG3	SA	MSA	SA
Egerek IgG2b	SA	SA	SA
Eger IgG2a	SA	SA	SA	SA
Egerek IgG1	MSA	MSA	MSA	MSA
Humán IgM	MSA	MSA		MSA	MSA	MSA
Humán IgE	MSA	MSA	MSA		MSA	MSA	SA
Humán IgD	MSA	MSA		MSA	MSA	MSA	SA
	Humán IgA	MSA	MSA		MSA	MSA	MSA	MSA<	SA
Humán IgG4	SA	SA	SA	SA	MSA	MSA	SA
Humán IgG3	SA		SA	MSA	MSA	MSA	SA
Human IgG2	SA	SA	SA	SA	MSA	MSA	MSA	SA
Humán IgG1	SA	SA	SA	SA	SA	MSA	MSA	SA
Ratkány IgM	RE	RE
Rat IgG2c	MSA	RE	MSA
Rat IgG2b	MSA	RE	MSA
Ratkány IgG2a	SA	RE	SA
Ratkány IgG1	MSA	RE	MSA	MSA
Ratkány IgG	MSA	SA	SA

Fragmentumok	Protein A/G Mix	Protein A	Protein G	Kappa Ig kötőanyag	Lambda Ig kötőanyag	Kappa/Lambda Mix*
Humán l								SA		MSA
Humán k				SA		MSA
Humán Fc	MSA	MSA	MSA
Humán scFv	MSA	MSA	MSA		RE	RE	RE	RE
Humán F(ab')2	MSA	MSA	MSA	MSA	MSA	MSA	MSA	SA
Humán F(ab)	MSA	MSA		MSA	MSA	MSA	MSA	SA
A és G fehérje relatív affinitásának kulcskódja; PureProteome™ Kappa és Lambda mágneses gyöngyök antitestekhez: SA = Erős affinitás; MSA = Mérsékelt/gyenge affinitás; RE = Értékelést igényel *A PureProteome™ Kappa/Lambda keverék nem katalóguscikk. Egyszerűen szerezze be a Kappa és Lambda gyöngyöket külön-külön, és keverje össze 1:1 arányban.