Betöltési kontrollok Western Blottinghoz
Chandra Mohan, Ph.D., Wayne Speckmann, Ph.D, Robin Clark, Ph.D
A Western blottingot leíró első publikáció óta (Renart et al., 1979) ezt az immunodetektálási technikát széles körben használják a sejtekből vagy szövetekből kivont komplex keverékekben lévő specifikus fehérjék azonosítására. A Western blotting három alapelemből áll:1 a fehérjék méretük szerinti elválasztása,2 szilárd hordozóra történő átvitel, és3 a célfehérjék jelölése megfelelő primer ellenanyaggal, majd vizualizáció, jellemzően konjugált másodlagos ellenanyaggal. Az eszközök és technikák későbbi finomítása - a nagy érzékenységű fluoreszcens jelölések kifejlesztésével együtt - jelentősen megnövelte a kimutatási határokat, és lehetővé tette a tudósok számára, hogy szövetspecifikus normális és betegségi útvonalakat vizsgáljanak. A tudósok azonban általában nehézségekkel szembesülnek, amikor kvantitatív Western blottingot használnak a fehérjeszintek változásainak azonosítására. Ennek oka, hogy sok fehérje eltérő expressziós mintázatot mutat a különböző szövetekben és különböző fiziológiai és patológiai körülmények között.
Western blotting: egy rutintechnika, amely nem egyszerű
Noha a Western blotting valószínűleg a leggyakrabban használt immunológiai alkalmazás, mégis van néhány kritikus technikai probléma, amelyet krónikusan figyelmen kívül hagynak. Például az izolálási vagy elválasztási protokollok befolyásolják-e a fehérje integritását vagy poszttranszlációs módosítását? Meg lehet-e különböztetni a fehérje degradációit vagy aggregációit a biológiai folyamatok releváns termékeitől? Ha az eredmény több sáv, hogyan lehet meghatározni, hogy melyik az eredmény, a variáció, a műtermék? (Gorr és Vogel, 2015)
A kvantitatív Western blot használható egy célfehérje relatív mennyiségének összehasonlítására olyan minták csoportjában, amelyek különböző egyéneket, kezelési körülményeket, betegségállapotokat vagy más biológiai változókat képviselhetnek. A teljes fehérjeszint pontos azonosítása és mérése érdekében több mintában, a tudósok belső standardként "betöltési kontrollokat" használhatnak. Ez a kontroll egy olyan fehérje elleni primer antitest hozzáadására utal, amelyről feltételezhető, hogy minden mintában jelen van, és amelynek relatív mennyiségét nem befolyásolják a biológiai eltérések vagy a kísérleti körülmények. A fehérjecélpontok, amelyek általában jó jelöltek a terhelő kontrollok számára, ubiquitását tekintve "házvezető" géntermékek. A betöltési kontrollok használata lehetővé teszi a minta betöltésének kvantitatív meghatározását az összes furatban az eredmények normalizálása érdekében, feltételezve, hogy a betöltési kontroll azonos a különböző mintasávok között. A töltéskontrollok használata védelmet nyújt a "peremhatás" ellen is, ami akkor fordul elő, amikor nagyszámú sávot használnak, és a külső sávokban lévő fehérjék a kerethez közelebbi pozícióban kerülnek a membránra, ami a blot szélénél intenzívebb festődést okoz. A terhelési kontrollok segítségével kimutatható, hogy a fehérjék terhelése változott-e, és ez magyarázatot adhat a célsáv(ok)ban megfigyelt eltérésekre. Megfelelő használat esetén a betöltési kontrollok biztosítják a fehérjék megfelelő mennyiségi meghatározását annak ellenére, hogy a Western blot összes sávjában a betöltési mennyiségben finom különbségek tapasztalhatók.
A β-aktin elleni monoklonális antitest (A5316) Western blot validálása. Az olyan konstitutívan expresszált fehérjéket, mint a β-aktin, a β-tubulin, a GAPDH és mások gyakran választják megrakodási kontrollként a kvantitatív Western blottinghoz. A betöltési kontrollok használata segít annak biztosításában, hogy a célfehérje mennyiségének látszólagos eltérései a releváns biológiai eltéréseknek, és nem a gélre töltött teljes fehérje mennyiségének következetlenségeinek köszönhetőek. Az alábbi táblázat más minta- és állapot-specifikus antitesteket sorol fel, amelyek hasznosak WB töltéskontrollként.
A betöltési kontroll antitestek kiválasztása
A béta-aktint és a béta-tubulint következetesen betöltési kontrollként alkalmazzák, mivel expressziójuk a legtöbb modellrendszerben viszonylag konstitutív. Néhány publikáció azonban megkérdőjelezte a β-aktin standard terheléskontrolként való használatának érvényességét (Ditmar és Ditmar, 2006; Eaton et al., 2013; Li és Shen, 2013) azzal az indokkal, hogy a β-aktin és β-tubulin szintje szövetenként eltérő, és expressziójukat patológiás állapotok befolyásolhatják. E publikáció szerzői a kvantitatív Western blottingban alternatív technikaként a teljes fehérjeelemzést javasolják, és azt javasolják, hogy a "házvezető" géntermékeket óvatosan kell használni a vizsgált gén expressziós mintázatának tanulmányozása után. Mindazonáltal a β-aktin és a β-tubulin bizonyos előnyöket kínálnak terhelő kontrollként: erősen konzerváltak, magas expressziós szintet mutatnak, és a legtöbb kísérleti körülmények között stabilitást mutatnak. Fontos megjegyezni, hogy a kontrollt a vizsgált szövet- vagy sejttípus alapján kell kiválasztani, és empirikus tesztelésre lehet szükség a terhelő kontroll egységességének ellenőrzéséhez.
Tippek a betöltési kontroll antitestek hatékony eredményeinek eléréséhez
A Western blotting variabilitásának leküzdéséhez és az adatértelmezési hibák csökkentéséhez, hasznos lehet az alábbi óvintézkedések közül néhány.
- Használjon olyan belső terhelési kontrollokat, amelyek stabilan expresszálódnak, és amelyeket a kísérleti körülmények minimálisan befolyásolnak.
- Válasszon terhelési kontroll antitestet olyan fehérje ellen, amelyről ismert, hogy konstitutívan expresszálódik a mintában.
- Használjon egy második terhelési kontrollt az első kontrollon kapott eredmények alátámasztására. Ez különösen új vagy újszerű minták esetében lehet érdemes.
- A betöltő kontrolloknak a molekulatömegek széles tartományát kell lefedniük, hogy a kiválasztott kontroll hasonló MW-tartományban, de ne azonos MW-tartományban legyen a célfehérjével. Ez biztosítja, hogy a cél- és a kontrollsávok könnyen megkülönböztethetők legyenek a bloton.
- A töltőkontroll antitestek gyakran olyan házvezető fehérjéket detektálnak, amelyek bőségesen expresszálódnak, ami a jel telítődéséhez vezet, különösen kemilumineszcens detektálási módszer alkalmazása esetén. A túltelítődés használhatatlanná teheti a töltéskontroll sávokat a referenciaként, elrejtheti a célfehérje mennyiségének mintáról mintára történő eltérését.
Titrálja a töltéskontroll antitest koncentrációját és a blot expozíciós idejét a felhasználandó mintával, mielőtt elkezdené, hogy a töltéskontroll jele a lineáris detektálási tartományon belül legyen.
Hivatkozások
Az olvasás folytatásához jelentkezzen be vagy hozzon létre egy felhasználói fiókot.
Még nem rendelkezik fiókkal?