Alkalikus foszfatáz

Alkalikus foszfatáz - vizsgálatok, molekulatömeg, szubsztrátok és szerkezet

• Szarvasmarha alkalikus foszfatáz
• E. coli Alkalikus foszfatáz
• Kagyló alkalikus foszfatáz

Alkalikus foszfatáz (ALP/ALKP) készítmények széles skáláját kínáljuk, melyeket optimalizáltunk konjugálás antitestekhez és más fehérjékhez ELISA, Western blotting és hisztokémiai kimutatás céljából. A BioUltra Grade alkalikus foszfatázunk nagyon magas specifikus aktivitással rendelkezik, ami különösen hasznos a fehérjék jelöléséhez, amikor nagy érzékenységre van szükség.

Western Blotting

1. ábra. FLAG-BAP kontrollfehérje, amelyet anti-FLAG antitesttel és ALP-jelölt másodlagos antitesttel detektáltak, és BCIP/NBT szubsztráttal festettek (ProteoQuest Colorimetric Western Blotting Kit, B6404 használatával).

Immunohisztokémia

2. ábra. Formalinban rögzített, paraffinba ágyazott humán mandula metszete, amelyet monoklonális Anti-Humán IgA és Anti-Eger IgG ALP-konjugátummal festettünk meg SIGMAFAST™ Fast Red TR/Naphthol AS-MX tabletta (kat. sz. F4523) mint szubsztrát felhasználásával. 40x

Termékeinket kazein és más fehérjék defoszforilálására is használják. Az ALKP felhasználható a DNS vagy RNS 5'-terminálisainak defoszforilálására az önligálás megakadályozása érdekében. A DNS vagy az RNS az ALKP-vel történő defoszforilációt követően radiomárkázott foszfáttal is jelölhető (T4 polinukleotid-kináz).

A DNS vagy RNS az ALKP-vel történő defoszforilációt követően is jelölhető.

Szarvasmarha alkalikus foszfatáz

A szarvasmarha bél ALP egy dimer, membránból származó glikoprotein.^1-3 Legalább három izoforma létezik, amelyek monomerenként jellemzően két N-kötött és egy vagy több O-kötött glikánnal rendelkeznek.² Az enzimnek cinkre, valamint magnézium vagy kalcium kétértékű ionokra van szüksége az aktivitáshoz.⁴

Az enzim széles specificitással rendelkezik az alkoholok, aminok, pirofoszfátok és fenolok foszfátésztereire. Rutinszerűen használják fehérjék és nukleinsavak defoszforilálására.^5-7

K_M: 1.5 × 10^-3 M (p-Nitrofenilfoszfát), 19 × 10^-3 M (foszfenolpiruvát)

Molekulatömeg:^2,3 140-160 kDa (dimer MW)
E₂₇₈1%: 7,6-10,5
Isoelektromos pont:^4,8,9 4,4-5,8 pI tartományba eső izoenzimek

pH optimum: Az enzim a 7,5-9,5 pH-tartományban a legstabilabb.³ Az enzimaktivitás pH-optimumát a pH 8-10 jelenti. A pH-optimum a szubsztráttól, a szubsztrátkoncentrációtól és az ionkoncentrációtól függően változik.⁸ Az enzimaktivitást ennél a terméknél pH 9-nél határozzák meg.8 (dietanolamin-puffer enzimvizsgálat).

Hőmérséklet hatása az aktivitásra és a stabilitásra

A szarvasmarha alkalikus foszfatáz gátlói

Kelátképzők, arzenát, cisztein, jód, szervetlen foszfát, pirofoszfát, diizopropilfoszfát, trifenilfoszfát, diizopropilfluorofoszfát és L-fenilalanin.^9,10

A levamisolt (katalógusszám L9756) jellemzően az endogén ALKP aktivitás gátlására használják, miközben csak kismértékben gátolja a bélben lévő enzimet.^11,12

vizsgálati protokollok

• Dietanolamin Assay
  
• Glicin Assay pH 8,8
• Glicin cinkkel Assay
  
• Glicin Assay pH 10,4
  

Egység meghatározása: Egy DEA egység percenként 1 µmol 4-nitrofenilfoszfátot hidrolizál pH 9,8-on, 37 °C-on. Körülbelül 3 DEA egység egyenlő egy glicin egységgel.

Az ALP-t a tejtermékek, például a tej és a sajt pasztőrözésének hatékonyságának meghatározására is használják. Az ALP denaturálódik, ha legalább 15 másodpercig körülbelül 72 °C-os hőmérsékletnek tesszük ki. Kevésbé szélsőséges hőmérsékleti körülményekről is bebizonyosodott, hogy elpusztítják a legtöbb tejben született kórokozót. Ezért az ALP-aktivitás felhasználható a pasztőrözés hatékonyságának mérésére. A múltban két módszert használtak a pasztőrözés utáni ALP-aktivitás ellenőrzésére, az első a Scharer-teszt, amely fenolt szabadít fel és mér. A második módszer az Aschaffenberg & Mullen teszt néven ismert. Ez a módszer a p-nitrofenol felszabadulását méri. Mindkét teszt esetében a negatív eredmény azt jelenti, hogy nincs ALP-aktivitás és a legtöbb tejben született kórokozó elpusztult. A közelmúltban új, érzékenyebb technikákat fejlesztettek ki, amelyek ugyanazon az ALP-aktivitás elvén alapulnak.

Hivatkozások

1. Hsu HH, Munoz PA, Barr J, Oppliger I, Morris DC, Vaananen HK, Tarkenton N, Anderson HC. 1985. Purification and partial characterization of alkaline phosphatase of matrix vesicles from fetal bovine epiphyseal cartilage. Purification by monoclonal antibody affinity chromatography. J. Biol. Chem..(260):1826-31.

2. NEUMANN H, LUSTIG A. 1980. The Activation of Alkaline Phosphatase by Effector Molecules. A Combined Kinetic and Hydrodynamic Study. Eur J Biochem. 109(2):475-480. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1980.tb04818.x

3. Fosset M, Chappelet-Tordo D, Lazdunski M. 1974. Intestinal alkaline phosphatase. Physical properties and quaternary structure. Biochemistry. 13(9):1783-1788. https://doi.org/10.1021/bi00706a001

4. Besman M, Coleman JE. 1985. Isozymes of bovine intestinal alkaline phosphatase. J Biol. Chem..(260):11190-3.

5. Fernley H. 1971. 18 Mammalian Alkaline Phosphatases.417-447. https://doi.org/10.1016/s1874-6047(08)60378-9

6. Morton RK. 1955. The substrate specificity and inhibition of alkaline phosphatases of cow's milk and calf intestinal mucosa. 61(2):232-240. https://doi.org/10.1042/bj0610232

7. Morton RK. 1955. The action of purified alkaline phosphatases on di- and tri-phosphopyridine nucleotides. 61(2):240-244. https://doi.org/10.1042/bj0610240

8. Latner AL, Parsons M, Skillen AW. 1970. Isoelectric focusing of alkaline phosphatases from human kidney and calf intestine. Enzymologia. 40(1):1-7.

9. Lazdunski M, Brouillard J, Ouellet L. 1965. ÉTUDE DES EFFETS ÉLECTROSTATIQUES SUR LE MÉCANISME D'ACTION CATALYTIQUE DE LA PHOSPHATASE ALCALINE INTESTINALE DE VEAU. Can. J. Chem.. 43(8):2222-2235. https://doi.org/10.1139/v65-300

10. Harlow E, Lane D. 1988. Antibodies: A Laboratory Manual. 1. New York: Cold Spring Harbor Larboratory Press.

11. STAGNI N, VITTUR F, DEBERNARD B. 1983. Solubility properties of alkaline phosphatase from matrix vesicles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 761(3):246-251. https://doi.org/10.1016/0304-4165(83)90072-7

12. van Belle H. 1972. Kinetics and inhibition of alkaline phosphatases from canine tissues. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 289(1):158-168. https://doi.org/10.1016/0005-2744(72)90118-0

13. Roger DM. 1938. Practical Experience with the Scharer Rapid Field Test for Pasteurization. Am J Public Health Nations Health. 28(11):1325-1327. https://doi.org/10.2105/ajph.28.11.1325

 

E. coli Alkalikus foszfatáz

E. coli Alkalikus foszfatáz

E. coli ALKP egy dimer, nem glikozilált fehérje, amelyről feltételezhető, hogy főként az E. coli periplazmatikus terében található. Legalább három izoforma létezik. Az enzimnek cinkre van szüksége, és az aktivitáshoz magnéziumionok is aktiválják.^1-3 A szarvasmarha enzimhez hasonlóan a E. coli enzimnek is széleskörű specificitása van a foszfátészterekre.¹

K_M: 0.02 × 10^-3 M (p-Nitrofenilfoszfát)⁴
Molekulatömegt:² 89 kDa (dimer MW)
E₂₇₈1%: 7,6-10,5²
Isoelektromos pont:⁵ 4-es pI-tartományban lévő izoenzimek.5
pH optimum: 8,0⁵

1. Reid TW, Wilson IB. 1971. 17 E. coli Alkaline Phosphatase.373-415. https://doi.org/10.1016/s1874-6047(08)60377-7

2. Anderson RA, Vallee BL. 1975. Cobalt(III), a probe of metal binding sites of Escherichia coli alkaline phosphatase.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 72(1):394-397. https://doi.org/10.1073/pnas.72.1.394

3. Savchenko A, Wang W, Vieille C, Zeikus J. 2001. [26] Alkaline phosphatase from Thennotoga neapolitana.298-305. https://doi.org/10.1016/s0076-6879(01)31067-4

4. Boulanger RR, Kantrowitz ER. 2003. Characterization of a MonomericEscherichia coliAlkaline Phosphatase Formed upon a Single Amino Acid Substitution. J. Biol. Chem.. 278(26):23497-23501. https://doi.org/10.1074/jbc.m301105200

5. Garen A, Levinthal C. 1960. A fine-structure genetic and chemical study of the enzyme alkaline phosphatase of E. Coli I. Purification and characterization of alkaline phosphatase. Biochimica et Biophysica Acta. 38470-483. https://doi.org/10.1016/0006-3002(60)91282-8

 

A garnéla alkalikus foszfatáz

A garnéla ALKP egy dimer fehérje, amelynek molekulatömege körülbelül 58 kDa, SDS-PAGE-vel meghatározva.

A garnélarák enzim alacsonyabb hőmérsékleten denaturálódik, mint az enzim más forrásai, ezért ajánlott DNS és RNS defoszforilációjához, ha a reakciót követő hőinaktiválási lépés szükséges.

Garnélarák alkalikus foszfatáz, kat. No. A2237

A DNS dephosphorylationjának eljárása