MIQE: Valós idejű PCR kísérlet szabványok

A mennyiségi valós idejű PCR (qPCR) lehetséges alkalmazásai az első leírás óta (Higuchi, 1993) exponenciálisan növekedtek. A kutatókat azonban frusztrálták az olyan komplikációk, mint a szennyeződés, az elégtelen amplifikáció, az alacsony érzékenység és a bizonytalanság a megfelelő statisztikai elemzéssel kapcsolatban. Egészen a közelmúltig nem volt konszenzus arról, hogy miként kezeljék ezeket az akadályokat.

Egy nemzetközi kutatócsoport, köztük Dr. Tania Nolan, a globális alkalmazás- és technikai támogatási vezetőnk, 2009-ben közzétette a MIQE (ejtsd: Mykee) irányelveket, hogy megoldja a megbízható qPCR-mérések elvégzésének kihívásait. A MIQE követésével Ön biztosan megbízhatóbb adatokat fog előállítani, és:

• Elősíti a kísérletek átláthatóságát
• Biztosítja a laboratóriumok közötti konzisztenciát
• Megtartja a tudományos irodalom integritását

A qPCR szolgáltatásaink, beleértve a primer- és szondatervezést, a vizsgálati protokollok fejlesztését,  a hibaelhárítást és az adatelemzési támogatást, betartják a MIQE-t, ami lehetővé teszi, hogy gyorsabban és magabiztosan publikálhassa vagy piacra dobhassa termékét.

A MIQE ellenőrzőlista gyors útmutatója

A MIQE Checklist for qPCR1	Fontosság2
Kísérleti terv
Kísérleti és kontrollcsoportok meghatározása	Ellengedhetetlen
Szám az egyes csoportokon belül	Elengedhetetlen
A vizsgálatot a központi laboratórium vagy a vizsgáló laboratóriuma végezte?	Kívánatos
A szerzők hozzájárulásának elismerése	Minta
leírás	Ellengedhetetlen
Feldolgozási eljárás	Elengedhetetlen
Fagyasztás esetén - módszer és milyen gyorsan?	Lényeges
Ha rögzítik - mivel és milyen gyorsan?	Lényeges
Minták tárolási körülményei és időtartama (különösen Ellengedhetetlen
Lényeges
A felhasznált további reagensek forrása	Kívánatos
A DNáz vagy RNáz kezelés részletei	Ellengedhetetlen
Szennyezettségi vizsgálat (DNS vagy RNS)
Kihozatal	Kívánatos
RNS integritás módszer/eszköz	Ellengedhetetlen
Cq a 3' és 5' transzkriptumok	Kívánatos
Gátlásvizsgálat (Cq hígítások, spike vagy egyéb)	Ellengedhetetlen
Reagensek gyártója és katalógusszáma	Kívánatos
CqS génspecifikus primingRT	Kívánatos
qPCR Target Information
Ha multiplex, hatékonyság és Essential
in silico specificity screen (BLAST, stb.)	Ellengedhetetlen
Pszeudogének, retropszeudogének vagy más homológok?	Kívánatos
Sorozatigazítás	Kívánatos
Az amplikon másodlagos szerkezetének elemzése	Kívánatos
Az egyes primerek elhelyezkedése exon vagy intron szerint (ha van)	Elkerülhetetlen
Milyen splice-változatokat céloznak meg?	Ellengedhetetlen
Kívánatos
Szondaszekvenciák	Ellengedhetetlen
Oligonukleotidok gyártója	Kívánatos
Tisztítási módszer	Kívánatos
Ellengedhetetlen
Primer, (szonda), Mg++ és	DMSO stb.)	Lényeges
A lemezek/csövek gyártója és katalógusszáma	Kívánatos
Teljes termociklikus paraméterek	Elkerülhetetlen
Reakció beállítása (kézi/robotikus)	Kívánatos
A qPCR eszköz gyártója	Elkerülhetetlen
qPCR validáció
Optimalizálás bizonyítása (gradiensekből)	Ellengedhetetlen
Standard görbék meredekséggel és y-interceptummal	Lényeges
PCR hatékonysága a meredekségből számolva	Ellengedhetetlen
A PCR-hatékonyság megbízhatósági intervalluma vagy standard hiba	Kívánatos
Ellengedhetetlen
Cq változása az alsó határértéknél	Kívánatos
Nyilvántartás a kimutatási határértékre vonatkozóan	Elkerülhetetlen
Multiplex vizsgálat esetén az egyes vizsgálatok hatékonysága és LOD-ja	Ellengedhetetlen
Cq módszer meghatározása	Ellengedhetetlen
A normalizálási módszer leírása	Ellengedhetetlen
A biológiai ismétlések száma és egyezősége	Kívánatos
A technikai ismétlések száma és foka (RT vagy qPCR)	Elkerülhetetlen
Megismételhetőség (vizsgálaton belüli eltérés)	CV)	Kívánatos
Teljesítményelemzés	Kívánatos
Statisztikai módszerek az eredmények szignifikanciájának megállapítására	Szükséges
Szoftver (forrás, verzió)	RDML	Kívánatos

¹Klinikai kémia Copyright 2009 by AMERICAN ASSOCIATION FOR CLINICAL CHEMISTRY, INC. Sokszorosítva az AMERICAN ASSOCIATION FOR CLINICAL CHEMISTRY, INC engedélyével, a Copyright Clearance Center-en keresztül történő internetes közzététel formájában.

²Minden lényeges információt a kézirattal együtt kell benyújtani. A kívánatos információkat is be kell nyújtani, ha rendelkezésre állnak. Ha a primerek az RTPrimerDB-ből származnak, akkor a qPCR-célpontra, az oligonukleotidokra, a protokollokra és a validálásra vonatkozó információk elérhetőek ebből a forrásból.

³Az RNS első extrakciójakor elengedhetetlen a DNS hiányának megállapítása a nem-reverz transzkripciós próba segítségével. Miután a minta DNS-mentességét validálták, a nem-reverz transzkripció nélküli kontroll bevonása kívánatos, de már nem elengedhetetlen.

⁴A szonda szekvenciájának közzététele nagyon kívánatos és erősen ajánlott. Mivel azonban nem minden kereskedelmi forgalomban kapható, előre megtervezett próbák szállítói adják meg ezt az információt, ez nem lehet alapvető követelmény. Az ilyen próbák használata nem javasolt.