Hibaelhárítás a PCR és RT-PCR erősítésben

A PCR és az RT-PCR gyakori problémái közül sokat a reakciótermékek agarózgél-elektroforézise során lehet azonosítani. Ezek közé tartozik a várt amplifikációs termék hiánya, a nem specifikus termékek jelenléte, a túlzott elkenődés és a "primer dimer" sáv jelenléte. Az alábbiakban összefoglaljuk e problémák lehetséges okait és megoldásait.

7.4. táblázat. A PCR- és RT-PCR-amplifikációval kapcsolatos problémák lehetséges okai és megoldásai.

probléma	lehetséges ok	megoldás
Nincs sáv a gélen	A termikus cikláló nem működött megfelelően	Ha nem készült pozitív kontroll, fontolja meg a reagensek tesztelését egy kontrollreakcióban, korábban megfelelően működőnek bizonyult templátokkal és primerekkel.
	Elégtelen vagy túl sok templát került hozzáadásra	Titrálja a rendszeréhez szükséges templát mennyiségét.
	A DNS esetében: A sablon minősége rossz volt vagy inhibitorokat tartalmaz	A tisztátalan DNS nem tud megfelelően felerősödni. Használjon frissen készített DNS-t, vagy izolálja a templát más módszerrel.
	A primer koncentrációja túl alacsony volt vagy nem volt kiegyensúlyozott	Vissza kell győződnie arról, hogy a primer koncentrációja az ajánlott tartományon belül van, és hogy a két PCR-primer koncentrációja azonos.
	Nukleázok kerültek be	Készítsen új sablont. Feltétlenül tartsa be a nukleázok bejuttatása elleni óvintézkedéseket. Ez különösen fontos, ha a kiindulási anyag RNS.
	RNS esetében: A sablon EDTA-t tartalmazó pufferben van		Az RNS-oldatban jelen lévő EDTA kelátolja az RT-PCR-hez szükséges Mg2+ -t, és nem optimális eredményekhez vezethet. Ennek kompenzálására adjon további Mg2+ -t a reakciók összeállításakor. A részleteket lásd a termék használati utasításában.
A reagenseket használat előtt nem olvasztották fel megfelelően	A reakciók összeállítása előtt olvasztja fel és alaposan keverje össze az összes reagenseket.
A primer lágyítási hőmérséklete túl magas volt	Nyomja le a lágyítási hőmérsékletet 2 °C-os lépésekben.
A denaturálási hőmérséklet nem volt optimális	Kísérelje meg növelni a hőmérsékletet vagy a kezdeti denaturálási lépés időtartamát. Ez különösen a GC-ben gazdag sablonok esetében hasznos.
A hosszabbítási idő túl rövid volt	Növelje a hosszabbítási időt. Ez különösen fontos lehet hosszú PCR esetén.
A termikus cikláló nem volt megfelelő hőmérsékleten	Javítsa meg/kalibrálja a termikus ciklálót, vagy használjon másik gépet.
Extra, nem specifikus sávok a gélen	Primerek hibridizálódtak a sablon másodlagos helyére		Tervezzen új primereket, amelyek kevésbé specifikusak a másodlagos helyre. Növelje a lágyítási hőmérsékletet 2 °C és 5 °C közötti lépésekkel.
	DNS-szennyeződés került a primerekbe vagy a pufferekbe	Futtasson negatív kontrollreakciót (templát nélkül). Készítsen friss anyagokat, ha szennyeződést észlel.
	RNS esetében: A sablon DNS-szennyeződött	Végezzen DNáz lépést, és teljesen inaktiválja/eltávolítsa a DNázt. Alternatívaként készítsen RNS-t más módszerrel.
Túl sok templát került hozzáadásra	Titrálja a templát mennyiségét a rendszeréhez.
Túl magas volt a primerkoncentráció	Titrálja a primerek mennyiségét a rendszeréhez.
A termikus cikláló nem a megfelelő hőmérsékleten volt	Javítsa meg/kalibrálja a termikus ciklálót, vagy használjon másik gépet.
A felszaporított DNS túlzott elkenődése&.nbsp;	Túl sok templát került hozzáadásra	Titrálja a templát mennyiségét a rendszeréhez.
	Túl sok ciklust hajtottunk végre	Rövidítse a ciklusok számát 35 alá.
	A termikus ciklizálás körülményei nem voltak optimálisak a termikus ciklere számára	Optimalizálja a feltételeket a gyártó ajánlásai alapján.
	A lágyítási hőmérséklet túl alacsony volt	Kész gyöngyök használata esetén szükség lehet a lágyítási hőmérséklet újraoptimalizálására. Növelje a lágyítási hőmérsékletet 2 °C és 5 °C közötti lépésekkel.
A primer koncentrációja túl magas volt	Titrálja a primerek mennyiségét a rendszeréhez.
A hosszabbítási idő túl hosszú volt	Visszaesett a hosszabbítási idő kis lépésekben.
DNS esetében: A sablon minősége alacsony volt	A tisztátalan DNS nem tud megfelelően amplifikálódni. Használjon frissen készített DNS-t, vagy izolálja a templát más módszerrel.
Túl sok DNS került a gélre	Újra lefuttassa kevesebb mintával.
Primer dimerek látható	Túl sok primer került hozzáadásra/ túl magas primerkoncentráció		Titrálja a primerek mennyiségét a rendszeréhez.
A primerek komplementer átfedő szekvenciával rendelkeznek	A primereket úgy tervezze meg, hogy elkerülje az önkomplementer belső szekvenciákat. Növelje a lágyítási hőmérsékletet. Használjon illustra™ Hot Start Mix PCR termékeket.