Gyenge adherens sejtmegkötődés hibaelhárítás

Mi befolyásolja a sejtek kötődését?

A sejtek optimális kötődése in vitro az egészséges sejteknek a közegben, a szérumban és a kiegészítőkben jelen lévő, sejtekből származó kötődési molekulák széles skálájával való kölcsönhatását igényli. Cultureware a felületeket gyakran kezelik extracelluláris mátrixfehérjékkel, például kollagénnel, fibronectinnel, lamininnel vagy más faktorokkal a kötődés megkönnyítése érdekében, bár sok adherens sejttípusnak nincs szüksége többre, mint a célnak megfelelő sejttenyésztési felületekre a sikeres kötődéshez és rétegek kialakításához.

1. ábra. Az extracelluláris mátrix (ECM) bevonat lehetővé teszi a magzati tüdő fibroblasztok gyors terjeszkedését. Az emberi magzati tüdő fibroblasztokból származó MRC-5 sejteket 24 órán át növesztették szövettenyésztő műanyagra történő kiültetés után, a kötődés fokozása érdekében extracelluláris mátrix géllel bevonva (balra) és bevonva (jobbra).

Az egészséges és megfelelően táplált sejtek újratervezik és optimalizálják kötődési mátrixaikat. A szuboptimális növekedési körülmények között tenyésztett sejtek rosszul kötődnek. Ha a biztosított tenyésztési felület megfelelő, akkor a sejtek szubsztrátra való kötődésének kudarcát leggyakrabban a környezeti stressz okozza. A tenyészetben lévő sejtekre ható stresszt a biofizikai körülmények vagy a közegben jelen lévő vagy képződő komponensek közvetítik.  További információért olvassa el itt. Problémákat tapasztal a 3D-s sejtmodelljeivel kapcsolatban? Tudjon meg többet a 3D-s sejttenyésztési módszerekről és protokollokról itt.

.

2. ábra. A sejtek egészségének és adhéziójának nyomon követése kultúrában.

A környezeti stresszhatások, amelyek megakadályozhatják az adherens sejtfenotípusok sikeres rögzülését, a következők:

• Kontamináció
• Inkubátor hőmérsékleti ingadozás
• Elégtelen vagy nem megfelelő sejtkultúra felület/alátét
• Nem megfelelő környezeti gázkeverék

Ha a fentiek mindegyike kizárható, a sejtek rögzülésének és monorétegek kialakulásának sikertelensége valószínűleg a sejttenyésztő közegben lévő nem megfelelő tápanyagoknak vagy a gázkörnyezetnek köszönhető. Az alábbi táblázat felsorolja az alapvető sejttenyésztő közegkomponenseket, és elmagyarázza, hogy ezek elhagyása vagy megváltozott koncentrációja hogyan okozhat sejtstresszt, amely a tenyésztési felületről való leváláshoz vezet. Ez a táblázat olyan tippeket tartalmaz, amelyek különösen hasznosak lehetnek a leválási problémák elhárításában a szérummentes media rendszerek.

Gyakori sejttenyésztési közegek és környezeti összetevők, valamint ezek funkciói hagyományos és szérummentes rendszerekben

Médiaösszetevő/molekuláris funkció		Elismerés a sejtkultúrához
Albumin
Albumin molekulák széles körét köti meg és stabilizálja. Ha kihagyjuk egy készítményből, az csökkentheti a közeg stabilitását. Az albumin csökkenti a sejtmembránok oxidatív károsodását is azáltal, hogy szabadgyök-nyelőként működik.	Ahol csak lehetséges, biztosítsa, hogy a médiumkészítmény tartalmazzon albumint. Az albumin hatékonysága nagymértékben változik, mivel aktivitásának nagy része a vele komplexbe kötött molekuláktól függ.
Aszkorbát/Aszkorbinsav
Az aszkorbinsav megállítja a lipidperoxidációt, amely lebonthatja a sejt membránokat, a sejtek leválását okozhatja. Vizes közegben gyorsan oxidálódik. Aszkorbát nélkül a sejtek csökkent kapacitással rendelkeznek az ECM-fehérjék, például az kollagén és elastin.	Adjunk hozzá ascorbate és glutathione kiegészítőként a médiához a felhasználáskor. A glutation az oldatban lévő aszkorbát regenerálására hat.
Kalcium<./b>
Változások a kalcium ionkoncentráció változása nagy valószínűséggel befolyásolja a sejtek kötődését és jelátvitelét.	Kerülje a közeg EDTA-val, egy kalcium kelátort tartalmazó anyag felvételét vagy szennyezését
Az extracelluláris kalciumkoncentráció általában sokkal magasabb, mint az intracelluláris szint. Az oxidatív stressz, valamint a rögzített sejtek áthaladására használt módszerek károsíthatják a sejtmembránokat, és lehetővé tehetik a kalcium gyors beáramlását a sejtbe. Ez leállítja a légzést és az általában a kötődéshez használt energiaforrásokat.	Kerülje el, hogy a membránok sérülésével járó sejteket normál kalciumkoncentrációnak tegye ki, amíg nem volt idejük a membránok helyreállítására.
Ceruloplazmin
A szérummentes és a fehérjeszegény táptalajok általában nem tartalmaznak ceruloplazmint. Következésképpen a réz rendelkezésre állhat a hidroxil szabad gyökök képződésének katalizálására, amelyek károsítják a sejttermékeket és a sejtmembrán kötőhelyeit.		Az albumin tartalmaz egy specifikus kötőhelyet a réz számára. Értékelje az albumin mint a réz átviteli módjának hatékonyságát.
Citrát
Citrát csökkentheti a kalcium hozzáférhetőségét a sejt számára, és csökkent sejtkötődést eredményezhet. A transferrin nélküli sejtrendszerekben a citrát olyan ionokkal versenyez, amelyek oldhatatlan sókat képeznek a vassal. Ha több vasat tartunk az oldatban, az növeli a szabadgyök-aktivitást a sejtfelszínen, és károsítja a sejtek kötőhelyeit.	El kell távolítani, illetve csökkenteni kell a citrát szintjét a csatolt sejttenyésztési rendszerekben. Citrátot csak olyan sejttenyésztési rendszerekben használjon, ahol a vas megkötésére transzferrint használnak, a réz pedig ceruloplazminban vagy albuminban van megkötve. Ha a transzferrin és a ceruloplazmin használata nem lehetséges, próbálja meg a citrát helyett az urátot használni a vas és a réz kelátképzésére.
Réz
Ha nincs copper hiányában számos sejtnek csökkent az olyan molekulák poszttranszlációs módosítására és keresztkötésére való képessége, mint a kollagén és az elasztin.	Adjunk hozzá rezet albumin komplexként. Tartsa a (réz + nikkel) és az albumin mólarányát kevesebb, mint egy az egyhez. Amikor csak lehetséges, a rezet a fiziológiailag megfelelő formában, a ceruloplazmin alkotórészeként adja.
Cisztein
Az oxidatív stressz hatására a sejtek megnövelik az cysteine a glutation termeléséhez. A cisztein korlátozott elérhetősége csökkenti a kötődési receptorok és fehérjék termelését.	Adjunk glutationt kiegészítésként a közeghez. Minimalizálja az oxidatív stresszt a rendszerben. Használjon többféle cisztein-poolt, például fehérjét (albumin) Kötött ciszteint vagy cisztein és 2-merkaptoetanol kevert szulfhidridjeit.
EDTA
EDTA a kalcium kelátora. A kalciumkoncentráció csökkentése a közegben gátolja a sejtek rögzülését. Transzferrin nélküli sejtrendszerekben az EDTA olyan ionokkal versenyez, amelyek oldhatatlan sókat képeznek a vassal. Azáltal, hogy az EDTA több vasat tart az oldatban, növeli annak esélyét, hogy a vas szabadgyökös eseményeket katalizáljon a sejtfelszínen vagy az extracelluláris mátrixokban, ami a sejtek kötődésének csökkenéséhez vezet.	Kerülje az EDTA használatát sejtkötő rendszerekben. Ha a sejtek előkészítésében használják (mint a tripszin/EDTA a leválasztáshoz), alaposan mossuk ki a sejteket.
Glutation
Az oxidatív stressznek kitett sejtek nem képesek elegendő mennyiségű redukált  glutathione  ahhoz, hogy megvédjék membránjaikat a károsodástól.	Adjunk glutationt a táptalajhoz kiegészítésként. A sejtkultúra során a szérummentes és fehérje nélküli táptalajokban ellenőrizze a glutation szintjét. A sejteket megfelelő és helyesen összeállított ciszteinforrással lássa el az optimális glutationszintézis arányának fenntartása érdekében.
Hidrogén-peroxid/hidroxil szabadgyökök
Hidrogén-peroxid vas- vagy rézionok jelenlétében hidroxil szabadgyököket képez. A hidroxil szabadgyökök megtámadhatják és lebonthatják az extracelluláris mátrixok sejtkötő doménjeit és kötőhelyeit.	Adjunk hozzá mannitot a hidrogén-peroxiddal való komplexképzéshez és stabilizálásához. Adjon hozzá szelént, hogy a glutation-peroxidáz aktív legyen. Egészítse ki a közeget glutationnal, hogy az aszkorbát teljesen redukált maradjon.
Vas
A vas közvetítheti a hidroxil szabadgyökök képződését, amelyek lebontják a sejt- és mátrixkötő helyeket, és a sejtek leválását okozzák a szubsztrátról.	Ahol csak lehetséges, használjon transzferrint a vas megfelelő szekvenálása érdekében a sejtekhez való eljuttatáshoz.
Magnézium
A sejtek rögzülését a magnézium támogatja. Az olyan sejtvonalakat, mint a Kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtek néha szuszpenziós kultúrákként tenyésztik. Ha a normálisan tapadó sejteket szuszpenziós kultúrában termesztik, a magnéziumszintet gondosan kell kezelni a csomósodás megelőzése érdekében.	A magnézium- és kalciumszintet az adott sejtkultúra-rendszerre vonatkozóan kell meghatározni. A szuszpenziós kultúrában a normálisan tapadó sejtek korlátozott mértékű csomósodása elfogadható. Ha a normálisan tapadó sejteket arra kényszerítjük, hogy egyes sejtekként növekedjenek, az valójában károsíthatja más funkciókat.
Mannit
A szérummentes és fehérje nélküli sejttenyésztési rendszerek hajlamosabbak az oxidatív stresszre, mint a szérummal kiegészített rendszerek.	Adjunk hozzá mannitot, mint védőmolekulát, amely megköti és segít stabilizálni a hidrogén-peroxidot.
Oxygén
A rögzített sejtek ki vannak téve az oxigénfeszültség és az oxidatív stressz gradiensének. Az oxigén által közvetített stressz lehet az oka annak, hogy a sejtek lekerekülnek és leválnak a szubsztrátjaikról.		Minimalizálja az oxidatív stresszt a rendszerben az ajánlott CO2 keverék fenntartásával a sejtinkubátorban.
Pyridoxal
A piridoxal reakcióba léphet a vassal és a ciszteinnel - különösen fény jelenlétében - és mérgező melléktermékeket hozhat létre.	Ha a sejtek képesek a piridoxint felhasználni, akkor azt használja piridoxal helyett. Amikor csak lehetséges, kerülje a piridoxál használatát szérum- vagy fehérje-mentes táptalajokban, amikor a vas nem komplexálódik transzferrinnel, és a táptalajt valószínűleg hosszabb ideig folyékony formában tárolják.
Piruvát
A piruvát a hidrogén-peroxid megkötésével segíthet az oxidatív stressz elleni védelemben a csatolt sejttenyésztési rendszerekben. A tiamin dekarboxilálással elpusztítja a piruvátot.	Piruváttal kiegészített közeg
Riboflavin
A fényhatás a riboflavin és hidrogén-peroxid képződését, ami oxidatív stresszhez vezet.	A sejtkultúra idején friss riboflavint adjon hozzá. Védje a sejtkultúra rendszert és a kondicionált tápfolyadékot a fénytől.
Selenium
Selenium a hidrogén-peroxidot elpusztító glutation-peroxidáz kofaktora. Azok a szérummentes közegek, amelyekből hiányzik ez a fém, hajlamosak a membránok károsodására.	A szelént alacsony koncentrációban (10-500 pM) adjuk hozzá. A szelén magas koncentrációja mérgező a sejtekre.
Tokoferol
Alfa-tokoferol gyakorlatilag nem oldódik vizes közegben és instabil vasionok és oxigén jelenlétében.	Az alfa-tokoferolt komplexként adjuk hozzá, amely oldatban tartja és lehetővé teszi az aszeptikus szűrést. Az alfa-tokoferolt a sejtek hozzáadása után aszeptikusan adjuk a táptalajhoz. Adjon alfa-tokoferolt liposzómákban. Ne adjon alfa-tokoferolt szérummentes vagy fehérje-mentes táptalajhoz, amely nem szekszterezett vasat tartalmaz. Adjon aszkorbátot az alfa-tokoferolt tartalmazó készítményekhez. Az aszkorbát regenerálja a membránhoz kötött alfa-tokoferolt.
Transzferrin
A sejtek szérummentes táptalajra való átnevelése a sejtek szérum (és transzferrin) csökkenő koncentrációjában történő tenyésztését jelenti. Alacsony szérumkoncentráció esetén előfordulhat, hogy nincs elegendő transzferrin a közegben lévő összes vas megkötéséhez. Ha a szérummentes és fehérje nélküli közegek nem tartalmaznak transzferrint, a vas katalizálhatja a hidroxil szabad gyökök képződését, amelyek károsíthatják a sejteket. Ha a transzferrin nincs jelen a készítményben, egyes sejtek az elválasztási folyamat során termelik azt. Ilyen esetekben egyensúlyt kell találni a sejtek vasra vonatkozó táplálkozási igénye és a citotoxicitás között.		Mérje a transzferrinszintet és a sejtkondicionált tápfolyadék vasmegkötő kapacitását. Az elválasztási folyamat során a teljes vas-transzferrin moláris arányt tartsa 0,5 és 1,5 között Amikor csak lehetséges, használjon transzferrint a vas megkötésére, szállítására és sejtekbe juttatására.
Cink
Cink a sejtek növekedéséhez nélkülözhetetlen ion. A cink koncentrációját sok sejtkultúra-készítményben nem szabályozzák. Gyakran az inzulin sójaként vagy az albumin vagy a szérum összetevőjeként adják hozzá.  A cink oxid-, peroxid-, karbonát-, hidroxil-, foszfát- és szulfid-anionok jelenlétében kicsapódik. A cink kicsapódás miatti elvesztése csökkentheti a sejtmembrán stabilitását és a szuperoxid-dizmutáz aktivitást.	Kísérleti úton határozzuk meg a cink só optimális koncentrációját, amelyet a szérum, az albumin és a cink-inzulin koncentrációjának meghatározása után a készítménybe kell tenni. A pH eltolódás elkerülése érdekében tartsuk fenn a megfelelő pufferkapacitást. A puffererősség növelésére kiegészítésként olyan pufferek használhatók, mint a HEPES vagy a MOPS. Oxidok, peroxidok és szulfidok képződnek oxidatív stressz esetén. Kövesse az oxidatív stressz elkerülésére vagy minimalizálására vonatkozó irányelveket. A közeg pH-értékének nátrium-hidroxiddal történő titrálásakor óvatosan járjon el. Kerülje az éles helyi pH-változásokat. Tegye ezt úgy, hogy alacsonyabb normális bázisoldatot használ, a bázist lassan adagolja, és gyorsan keverje a közeget. Amikor csak lehetséges, adjon cinket komplexként albuminnal vagy inzulinnal.

Kapcsolódó termékek

Albumins (BSA)	ECM fehérje	3D-hidrogél	Cellkultúra-médium-kiegészítők	Antitestek
TrueGel3D™	Kultúraszubsztrátumok/ECM	CRISPR genomszerkesztés	Növekedési faktorok	ECACC sejtvonalak