10. sejttenyésztési protokoll: A sejtek vizsgálata mikoplazma-szennyezettségre Hoechst DNS-festéssel

ECACC Laboratory Handbook 4th Edition

Aim

A DNS festési módszerek, mint például az indirekt Hoechst festési technikák gyorsak, az eredmények 72 órán belül rendelkezésre állnak, ami kedvezően hasonlítható össze a 4 hetes festési technikákkal.nbsp;mycoplasma kimutatása tenyésztéses izolálással. A sejtvonalak közvetlenül DNS-festéssel 24 órán belül eredményt adhat, azonban jóval csökkentett érzékenységgel (~10⁶ cfu/mL). Ez javítható a vizsgált sejtvonal egy indikátor sejtvonal, például Vero jelenlétében történő együttes tenyésztésével. Ez a dúsítási lépés 100 cfu/mL tenyészet érzékenységét eredményezi, és ez az ECACC által használt, előnyben részesített módszer. Ez a lépés szintén javítja az érzékenységet azáltal, hogy növeli azt a felületet, amelyen a mikoplazma meg tud tapadni. A tenyésztéssel történő kimutatáshoz hasonlóan a DNS-festési módszerek is alkalmasak a mikoplazma sejttenyészetekből vagy sejttenyésztési reagensekből történő kimutatására.

Anyagok

• Cellkultúra-médiumok: a megfelelő hőmérsékletre előmelegítve (a megfelelő médiumot és hőmérsékletet lásd az ECACC sejtvonal adatlapján.)
• Methanol (322415)
• Ecetsav jégsavas (A6283)
• Hoechst 33342 festőoldat (B2261)
• Indikátor sejtek e.g. Vero sejtek (84113001)
  - Mycoplasma hyorhinis NCTC10130 és
  . - Mycoplasma orale NCTC 10112

Készülékek

• Egyéni védőfelszerelés (steril kesztyű, laboratóriumi köpeny, védőszemüveg)
• 37 °C-ra beállított vízfürdő
• Mikrobiológiai biztonsági szekrény a megfelelő elszigeteltségi szinten
• CO₂ 37 °C-ra beállított inkubátor
• Mikroszkóp (UV Epi-Fluoreszcencia.)
• Szövettenyésztő edények
• Multi-edény 12 lyukú
• Mikroszkópos tárgylemezek és 13 mm-es fedőlapok
/li>
• Alumíniumfólia

Eljárás

1. A steril fedőlapokat helyezze szövettenyésztő edényekbe/lemezekbe, pl. 12 lyukú lemezekbe.
2. Inokuláljon 2 ml indikátorsejtet az előkészített edényekbe, pl. 2 x 10⁴ Vero sejteket a 12 lyukú lemez egy lyukába.
3. Inkubáljuk 37 °C-on, 5% CO₂ -ban 2-24 órán át, hogy a sejtek megtapadjanak a fedőlemezeken.
4. Hozzuk szuszpenzióba a hozzátapadt teszt-sejtvonalakat egy sejtkaparó segítségével. A szuszpenziós sejtvonalak közvetlenül is vizsgálhatók.
5. Vegyünk ki 1 ml tenyésztési felülúszót a duplikált lyukakból, és adjunk mindegyikbe 1 ml vizsgálati mintát. Oltasson be 2 kutat minden pozitív kontroll szervezet 100 cfu-val.
6. A duplikált szövettenyésztési kutakat hagyja beoltatlanul negatív kontrollként.
7. Inkubálja az edényeket 37 °C-on, 5% CO2 mellett 3-5 napig.
8. 3-5 nap elteltével fixáljuk a sejteket fedőszivacsra úgy, hogy minden egyes tálba legalább 2 ml frissen elkészített Carnoy-fixálószert (1:3 jégecetsav: abszolút metanol) adunk, és 3 percig hagyjuk állni. Ezután dekantáljuk a mérgező hulladékot tartalmazó palackba. Ismételje meg még egyszer. Adjunk hozzá legalább 2 ml Hoechst festéket 0,4μg/nl. Hagyja 3 percig a közvetlen fénytől védve, pl. alumíniumfóliával letakarva.
9. Dekantálja a felhasznált és fel nem használt festéket a mérgező hulladékba.
10. Adjon 1 csepp mountantot egy előre felcímkézett mikroszkópos tárgylemezre, és helyezze a fedőlemezt (sejtes oldallal lefelé) a tárgylemezre.
11. Tartsa a tárgylemezt alumíniumfóliával letakarva, és hagyja, hogy 37 °C-on legalább 15 percig, vagy szobahőmérsékleten 30 percig szilárduljon.
12. Nézze meg a tárgylemezt UV Epi-fluoreszcencia alatt 100x.

Az érvényes eredmény kritériumai

A negatív kontrollok nem mutatják a mikoplazma fertőzés bizonyítékát; a pozitív kontrollok mutatják a mikoplazma fertőzés bizonyítékát; a Vero sejtek egyértelműen fluoreszkáló sejtmagok formájában láthatóak.

A pozitív eredmény kritériumai

A mikoplazmával fertőzött minták fluoreszkáló sejtmagok és a mikoplazma DNS extra-nukleáris fluoreszcenciája (kis kokkuszok vagy filamentumok) látható.

A negatív eredmény kritériumai

A nem fertőzött minták fluoreszkáló sejtmagok formájában jelennek meg sötét háttér előtt. Nem lehet bizonyíték a mikoplazma jelenlétére, azaz a mikoplazma-DNS magon kívüli fluoreszcenciájára.

Jegyzetek

1. A DNS-festékek, mint például a Hoechst-festék, specifikusan kötődnek a DNS-hez. Minden kultúrában a sejtmagok fluoreszkálni fognak. Elméletileg a nem fertőzött tenyészetekben csak a sejtmagok fluoreszkálnak, míg a mikoplazma pozitív tenyészetekben apró kokkuszok vagy filamentumok találhatók, amelyek adszorbeálódhatnak vagy nem adszorbeálódhatnak a sejtekre (11. ábra). Felhívjuk azonban a figyelmet arra, hogy minden idegen DNS is fluoreszkálni fog, pl. a sejttörmelék - amit néha összetévesztenek a mikoplazma-szennyeződéssel.
2. A Hoechst festék mérgező, ezért óvatosan kell kezelni és eldobni.
3. Az eredmények bizonyos esetekben a következő okok miatt nehezen értelmezhetők:
   - Bakteriális/eleség/gombás szennyeződés
   - Túl sok törmelék a háttérben (mint a hibridoma sejtvonalak esetében)
   - Törött sejtmagok, mivel a sejtek mind elhaltak
   . - Túl kevés vagy egyáltalán nem élő sejt
4. Bár ez az eljárás pozitív kontrollok használatát javasolja, ez nem feltétlenül megvalósítható vagy kívánatos egy korlátozott erőforrásokkal rendelkező sejttenyésztő létesítményben. Ha pozitív kontrollokat kell használni, azt a fő szövettenyésztő létesítménytől elkülönített laboratóriumban kell végezni. Ha nem használnak pozitív kontrollokat, akkor erősen ajánlott, hogy egy független vizsgáló laboratóriumot bízzon meg a sejtvonalak rendszeres vizsgálatával.
5. Az ECACC azt ajánlja, hogy a megbízhatóbb eredmény érdekében a mintákat legalább két kimutatási módszerrel (pl. indirekt DNS-festéssel és tenyészetek izolálásával) vizsgálják meg mikoplazma szempontjából. Ennek oka, hogy a módszerek kimutatási érzékenysége a különböző mikoplazmafajok esetében eltérő.

AzECACC olyan mikoplazma-vizsgálati szolgáltatást kínál, amelyben három különböző kimutatási módszer áll rendelkezésre, azaz PCR, indirekt DNS-festés és tenyésztéses izolálás.