Histidin-jelölt fehérjék tisztítása IMAC Sepharose^® nagy teljesítményű szefarózzal ^{segítségével}

IMAC Sepharose^® High Performance egy töltés nélküli kromatográfiás közeg, amely 34 µm-es, erősen térhálósított 6%-os agaróz gyöngyökből áll, amelyekhez kovalensen kapcsolódott egy kelátképző csoport. Ezt a kelátképző csoportot a felhasználó megfelelő fémionokkal tölti fel, lehetővé téve a médium számára a célfehérjék szelektív visszatartását. A kis gyöngyméret lehetővé teszi a nagy kromatográfiás felbontást, a koncentrált anyagot tartalmazó, jól elkülönülő csúcsokkal. A kromatográfiás közeg nagymértékben kompatibilis számos adalékanyaggal, és jól alkalmazható olyan nagy teljesítményű tisztításokhoz, amelyek az eluátumban koncentrált termékeket eredményeznek. 1. melléklet (A Ni Sepharose^®, Ni Sepharose^® excel, TALON^® Superflow, és a töltetlen IMAC Sepharose^® termékek) mutatja az IMAC Sepharose^® High Performance főbb jellemzőit.

Az IMAC Sepharose^® High Performance-t 20%-os etanolban előduzzasztva szállítjuk.

3.47. ábra. Az IMAC Sepharose^® High Performance fémionoktól mentes, így számos alkalmazásban használható hisztidinnel jelölt és natív fehérjék tisztítására. 25 ml-es és 100 ml-es laboratóriumi kiszerelésben, valamint előrecsomagolt HiTrap™ IMAC HP 1 ml-es és 5 ml-es HiTrap™ IMAC HP oszlopokban kapható.

Az oszlop csomagolása

Lássa a termékhez mellékelt útmutatót, vagy olvassa el a 6. függelék (oszlopcsomagolás és előkészítés) az oszlopcsomagolásra vonatkozó általános iránymutatásokhoz.

Mintaelőkészítés

Ez a mintaelőkészítési eljárás az összes IMAC Sepharose^® High Performance-t tartalmazó formátumhoz alkalmazható. 

A mintát a kötőpuffer összetételéhez és pH-értékéhez igazítja puffer, NaCl, imidazol és adalékanyagok hozzáadásával koncentrált törzsoldatokból; a minta kötőpufferrel történő hígításával; vagy puffercserével. A gazdasejt fehérjék exponált hisztidinnel való kötődésének megakadályozása érdekében elengedhetetlen, hogy a mintába és a kötőpufferbe alacsony koncentrációban imidazolt tegyünk (4. fejezet, A hisztidin-jelölésű fehérjék tisztításának optimalizálása).

A mintát közvetlenül a minta felvitele előtt egy 0,22 µm-es vagy egy 0,45 µm-es filteren keresztül kell vezetni és/vagy centrifugálni. Ha a minta túl viszkózus, hígítsa kötőpufferrel, hogy megakadályozza az eltömődést; fokozza a líziskezelést (szonikáció, homogenizálás); vagy adjon hozzá DNáz/RNáz-t a nukleinsavfragmentumok méretének csökkentésére.

Puffer előkészítés

Megkötő puffer:		20 mM nátrium-foszfát, 0.5 M NaCl, 20-40 mM imidazol, pH 7,4. Az optimális imidazol-koncentráció fehérjefüggő; 20-40 mM sok fehérje esetében megfelelő.)
Elúciós puffer:		20 mM nátrium-foszfát, 0,5 M NaCl, 500 mM imidazol, pH 7,4.

A pufferkészítéshez használt víznek és vegyszereknek nagy tisztaságúnak kell lenniük. A puffereket felhasználás előtt 0,45 µm-es szűrőn keresztül szűrje. Használjon nagy tisztaságú imidazolt, mivel ez nagyon alacsony abszorbanciát vagy egyáltalán nem ad abszorbanciát 280 nm-en.

A legjobb tisztaság és hozam eléréséhez szükséges optimális imidazol-koncentráció a mintában és a pufferben fehérjéről fehérjére változik. A kötőpufferben 20-40 mM imidazol sok fehérje esetében megfelelő; az elúciós pufferben 500 mM imidazol biztosítja a célfehérje teljes elúcióját.

A kromatográfiás közeg feltöltése fémionnal

1. Készítsen 0,1 M oldatot a kívánt fémionból (pl., Cu²⁺, Zn²⁺, Co²⁺, Fe³⁺ vagy Ni²⁺) desztillált vízben. Használhatók kloridok, szulfátok stb. sói (pl, 0,1 M CuSO₄ vagy 0,1 M NiSO₄).

A Zn²⁺ -ionok oldatainak pH-értéke körülbelül 5,5 vagy annál alacsonyabb kell, hogy legyen, hogy elkerüljük a 6-os vagy magasabb pH-nál fellépő oldhatósági problémákat. A Fe³⁺ ionokat alacsony pH-n (kb. pH 3,0) kell immobilizálni, hogy elkerüljük az oldhatatlan vasvegyületek képződését.

1. Mossuk át az oszlopot legalább 2 térfogatnyi desztillált vízzel.
2. A fémion oldatból legalább 0,2 térfogatnyit alkalmazzunk az oszlopon.
3. Mossa az oszlopot legalább 5 térfogatnyi desztillált vízzel a felesleges fémionok eltávolítása érdekében.

A fémionoldat felvitele előtt csak vízzel mossa, pufferrel nem, különben nem kívánt kicsapódás léphet fel.

Az oszlopot nem kell minden egyes tisztítás között lecsupaszítani és újratölteni, ha ugyanazt a fehérjét akarjuk tisztítani. Bármely tisztítóoszlop újrafelhasználása a minta jellegétől függ, és a keresztkontamináció elkerülése érdekében csak azonos jelölésű fehérjékkel szabad elvégezni. A témával, valamint a tisztítással és tárolással kapcsolatos további információkért lásd 1. függelék (A Ni Sepharose, Ni Sepharose^® excel, TALON és TALON jellemzői)sup>® Superflow és a töltés nélküli IMAC Sepharose^® termékek).

Az IMAC Sepharose^® High Performance kompatibilis a redukálószerekkel. Javasoljuk azonban a gyengén kötött fémionok eltávolítását a redukálószereket tartalmazó puffer/minták alkalmazása előtt. Ez redukálószerek nélküli vakfuttatással érhető el (lásd alább). Ne hagyja vagy tárolja az IMAC Sepharose^® High Performance-t redukálószereket tartalmazó pufferekkel.

A fémionok szivárgása minden normál körülmények között alacsony. Kritikus alkalmazások esetén a tisztítás során fellépő szivárgás csökkenthető a minta betöltése előtti vakfutás elvégzésével (az alábbiakban leírtak szerint).


Vakifutás:

Megkötő puffert és elúciós puffert használjon redukálószer nélkül.

1. Mossa át az oszlopot 5 térfogatnyi desztillált vízzel (a 20%-os etanol eltávolítása érdekében).
2. Mossuk át 5 térfogatnyi elúciós pufferrel.
3. Egyensúlyozzuk 10 térfogatnyi kötőpufferrel.

Purifikáció

1. Ha szükséges, mossuk ki a 20%-os etanolt 5 térfogatnyi desztillált vízzel. Használjon 50-100 cm/h flow sebességet. Lásd a 8. függelék (Áramlási sebességről térfogatáramra történő átszámítás) című részt a flow rate számításokhoz.
2. Ekvibrálja az oszlopot 5-10 térfogatnyi kötőpufferrel 150 cm/h flow sebességgel.
3. Alkalmazza az előkezelt mintát.
4. Mossa az oszlopot kötőpufferrel, amíg az abszorbancia el nem éri az alapvonalat.
5. Elúciózza elúciós pufferrel lépcsős vagy lineáris gradiens alkalmazásával. Lépcsős elúció esetén általában 5 oszloptérfogat elúciós puffer elegendő. Lineáris gradiens elúció esetén egy sekély gradiens, több mint 20 oszloptérfogatú, hasonló kötőerősségű fehérjéket választhat szét.
6. Elúció után regenerálja az oszlopot 5-10 térfogatnyi kötőpufferrel történő mosással. Az oszlop most már készen áll az újabb tisztításra.

A₂₈₀ mérésekhez használja az elúciós puffereket üres pufferként. Ha az imidazolt el kell távolítani, használjon sótalanító oszlopot (11. fejezet, Sótalanítás/puffercsere és koncentrálás). A gyenge minőségű imidazol jelentős háttérabszorbanciát ad 280 nm-en.