ELISA eljárások

• Indirekt ELISA
  
• Capture ELISA

Indirekt ELISA

Reagensek és felszerelés

1. Foszfát pufferelt sóoldat (PBS) tabletta: 10 mM foszfátpuffer, pH 7,4, 150 mM NaCl (termékszám  P4417) és 0,1% nátrium-azid (termékszám  S2002).
2. Karbonát-bikarbonát pufferkapszula, pH 9,6 (termékszám  C3041).
3. Mosópuffer (PBS-T): 10 mM foszfátpuffer pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20 (termékszám P3563).
4. Monoklonális primer antitest.
5. Az antitest kontrollok: faj- és izotípus-illesztett, nem specifikus immunglobulin (pl., egér myeloma fehérjék, mint egér monoklonális primer antitest kontrollja)
6. Alkalikus foszfatázzal konjugált másodlagos antitest vagy peroxidázzal konjugált másodlagos antitest
7. Szubsztrát az alkalikus foszfatázzal konjugált másodlagos antitesthez (pl. SIGMAFAST™ pNPP tabletta, termékszám. N1891) vagy peroxidázzal konjugált másodlagos antitest szubsztrátja (például SIGMAFAST™ OPD tabletta, termékszám. P9187).
8. Stopping reagens az alkalikus foszfatázhoz: 3 M NaOH (opcionális) vagy stopping reagens a peroxidázhoz: 3 M HCl vagy 3 M H₂SO₄  (opcionális).
9. Mikrotiterlemezek
10. Mikrotiterlemez-olvasó 405 nm-es vagy 450/492 nm-es szűrővel (a pNPP vagy OPD esetében).
    

Eljárás

• Antigénbevonás
  
• Primer antitest reakció
  
• Sekunder antitest alkalmazása
  
• Subsztrát előkészítés
  
• Kifejlesztés

Antigénbevonat

1. Készítsen megfelelő koncentrációjú antigénoldatot karbonát-bikarbonát pufferben vagy PBS-ben.
2. Pipettázzon 0,2 ml-t a fenti oldatból a mikrotiterlemez minden egyes mélyedésébe.
3. Inkubáljon 37 °C-on 30 percig, vagy inkubáljuk (lefedve) egy éjszakán át 4 °C-on.
4. Vegyük ki a bevonóoldatot. Mosson háromszor PBS-T-vel.
   
   Megjegyzés: Ha nem specifikus kötődéssel kapcsolatos problémák merülnek fel, további blokkolási lépésre (30 perc. 5% BSA-PBS) lehet szükség. További információért lásd: Vogt, R.F., et al., J. Immunol. Meth, 101, 43 (1987).

Primer antitest reakció

1. Hígítsuk fel a monoklonális primer antitestet PBS-T-ben. Az optimális hígítást titrálási próbával kell meghatározni.
2. Adjunk 0,2 ml hígított monoklonális antitestet minden egyes mélyedésbe. A negatív kontroll legyen faj- és izotípus-illesztett, nem specifikus immunglobulin, amelyet PBS-T-ben hígítottunk.
3. Inkubáljuk szobahőmérsékleten 2 órán át.
4. Mossuk le, mint az Antigénbevonat 4. lépésben.

Sekunder antitest alkalmazása

1. Hígítsa fel az enzimkonjugált másodlagos antitestet PBS-T-ben. Adjon 0,2 ml-t ebből az oldatból minden egyes mélyedésbe. Az optimális hígítást titrálási próbával kell meghatározni.
2. 2 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk.
3. Mossuk le az antigénbevonat 4. lépése szerint.

Szubsztrát előkészítése

1. Az utolsó inkubáció során és közvetlenül a felhasználás előtt készítse el az enzimszubsztrátot, vagy hozza szobahőmérsékletre az előre elkészített folyékony szubsztrátot.

Kifejlesztés

1. Adjunk hozzá 0.2 ml frissen elkészített szubsztrátot minden egyes mélyedésbe.
2. A pozitív mélyedésekben 30 perc elteltével színt kell kifejlődnie (sárga vagy narancssárga színt, a pNPP, illetve az OPD esetében).
3. Az abszorbancia leolvasható közvetlenül a mikrolemez olvasóban (405 nm-en vagy 450 nm-en, a pNPP vagy OPD esetében), vagy a reakció leállítható a megfelelő leállító reagens kútonkénti 50 µl-ével, és az abszorbancia később leolvasható (405 nm-en vagy 492 nm-en, a pNPP vagy OPD esetében).
.

Capture ELISA

A capture ELISA (más néven "szendvics" ELISA) egy érzékeny vizsgálat, amellyel pikogrammtól mikrogrammig terjedő mennyiségű anyagok (például hormonok, sejtjelző vegyi anyagok, fertőző betegségek antigénjei és citokinek) kvantitatív meghatározására alkalmas.). Az ilyen típusú ELISA-kialakításra több okból is szükség lehet a direkt vagy indirekt ELISA helyett. Az elemzendő anyag túl híg lehet ahhoz, hogy a polisztirol mikrotiterlemezhez kötődjön (például egy sejtkultúra felülúszójában lévő fehérje), vagy nem kötődik jól a műanyaghoz (például egy kis szerves molekula). Előfordulhat, hogy túl sok más anyaggal keveredik ahhoz, hogy jól kötődjön a lemezhez, Két Sigma készlet, amely leírja vagy felhasználja a capture ELISA-t, a TNF-alfa készlet és a Mouse Isotyping Reagents kit (Product No. ISO2).

Reagensek és felszerelés

1. Foszfát pufferelt sóoldat (PBS): 10 mM foszfátpuffer, pH 7,4, 150 mM NaCl tabletta (termékszám  P4417) és 0,1% nátrium-azid (termékszám. S2002)
2. Karbonát-bikarbonát puffer kapszula, pH 9.6 (Termékszám  C3041)
3. Mosópuffer (PBS-T): 10 mM foszfátpuffer pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20 (terméksz. P3563)
4. Fogó vagy bevonó antitest
5. A standard görbéhez használandó kontroll antigén
6. Márkázott detektáló antitest
7. Szubsztrát. Általában a legérzékenyebb szubsztrátot használják (például TMB vagy OPD, ha peroxidázt használnak enzimjelölésként).
8. Stop oldat (opcionális)
9. Mikrotiterlemezek
10. Mikrotiterlemez olvasó
    

Eljárás

• A befogott antitest bevonása
  
• A kontroll és a minták felvitele
  
• A detektáló antitest alkalmazása

Megjegyzés: Ezt általános protokollként adjuk meg. A befogadó antitest, a minták, a kontrollok és a detektáló antitestek optimális hígításait, valamint az inkubációs időket empirikusan kell meghatározni, és kiterjedt titrálást igényelhet. Ideális esetben az ebben az eljárásban leírtaknak megfelelően enzimmel jelölt detektáló antitestet használunk. Ha azonban a detektáló antitest nem jelölt, a másodlagos antitest nem tud keresztreakcióba lépni sem a bevonó antitesttel, sem a mintával. A megfelelő negatív és pozitív kontrollokat is be kell vonni.

A befogadó antitest bevonása

1. A befogadó vagy bevonó antitestet megfelelően hígítsa fel karbonát-bikarbonát pufferben vagy PBS-ben. A befogadó antitesteket jellemzően 0,2-10 µg/ml-es koncentrációban adagoljuk. Előnyös az affinitással tisztított antitestek használata, vagy legalább IgG frakció használata.
2. Pipettázzon 0,2 ml hígított befogadó antitestet egy mikrotiterlemez minden egyes mélyedésébe.
3. Inkubálja a lemezt (lefedve) 1 órán át 37 °C-on.
4. Vegye ki a bevonóoldatot. Mossa a lemezt 3-szor mosópufferrel (PBS-T).

A kontroll és a minták alkalmazása

1. Adjon hozzá 0.2 ml megfelelően hígított mintát és kontrollt a megfelelő mélyedésekbe. A mintákat általában 10 ng-10 µg/well tartományban hígítjuk PBS-ben (minél érzékenyebb a vizsgálat, annál kevesebb minta szükséges).
2. Inkubáljuk a lemezt szobahőmérsékleten 1 órán át.
3. Vegyük ki a minta- vagy kontrolloldatot. Mossa ki a lemezt 3-szor mosópufferrel (PBS-T).

A detektáló antitest alkalmazása

1. Hígítsa fel az enzimekkel jelölt detektáló antitestet.
2. Pipettázzon 0,2 ml megfelelően hígított detektáló antitestet minden egyes mélyedésbe.
3. Inkubálja a lemezt szobahőmérsékleten 30 percig.
4. Vegye ki a detektáló antitest oldatot. Mossa a lemezt 3-szor mosópufferrel (PBS-T).
5. Adja hozzá a megfelelő szubsztrátoldatot.
6. Hagyja a lemezt fejlődni (általában 30 perc), és adjon hozzá stop oldatot (opcionális).
7. Olvassa le az abszorbanciát a megfelelő hullámhosszon egy mikroplatta olvasóban.

Hivatkozások

1. Harlow E, Lane D. 1988. Antibodies: A Laboratory Manual. 1. New York: Cold Spring Harbor Larboratory Press.

2. Hornbeck P. 1992. Enzyme-Linked Immunosorbent Assays. Current Protocols in Immunology. 1(1):2.1.1-2.1.22. https://doi.org/10.1002/0471142735.im0201s01

3. Crowther JR. Basic Immunology.1-34. https://doi.org/10.1385/0-89603-279-5:1

4. Deshpande SS. 1996. Enzyme Immunoassays. https://doi.org/10.1007/978-1-4613-1169-0

5. 1996. Immunoassay. Elsevier.

6. Feren?ík M. 1993. Handbook of Immunochemistry. https://doi.org/10.1007/978-94-011-1552-0

7. Tijssem P. 1985. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Practice and Theory of Enzyme Immunoassays. 15. Elsevier B.V.