Conferma^® ELISA: A minta kimutatása és a vizsgálat konzisztenciája a tervezéssel

Ha erős mintadetektálásra és hosszú távú vizsgálati konzisztenciára van szüksége, forduljon a Conferma^® ELISA-khoz. Az ELISA-kat házon belül fejlesztjük és gyártjuk a kritikus reagensektől a kész tesztekig, és nagy hangsúlyt fektetünk a tételről tételre konzisztens teljesítményre. 

A Conferma^® ELISA elvek összefoglalása:

• Teljes 96 lyukú tesztek, beleértve a minőségellenőrzéseket (alacsony, közepes, magas)
• Kritikus reagensek szigorúan fiziokémiai értékeléssel tételről tételre
• A reprodukálhatóság megerősítése céljából megállapított arany standardok
• Endogén minta áthidalása, mint tételfelszabadítási teszt

1. ábra. A Conferma^® ELISA-k magas mintadetektálási és tételenkénti konzisztenciát biztosítanak. (A.) A minta %-os (kimutatási határérték feletti, vagy LOD) kimutatása normál és beteg szérummintákban a Conferma^® ELISA-k segítségével a TNF-α, IL-6, IL-8 és MCP-1 analitekre. (B.) Példa a TNF-α ELISA kész kit vizsgálatára. A 3 tételből származó kalibrációs görbéket hasonlították össze a matematikai hasonlóság szempontjából, ahol az 1 érték tökéletes párhuzamosságnak minősül. Az 1., 2. és 3. tételt a kék, sárga és magenta vonalak jelölik. A 2. tétel és az 1. tétel párhuzamossága 0,983, a 3. tétel és az 1. tétel párhuzamossága pedig 0,992 volt.

A Conferma^® ELISA-módszer bevezetése

A kizárólag kutatási célú (RUO) vizsgálatokat a felfedezéstől a klinikai vizsgálatokig a vizsgálatok széles körében alkalmazzák. Bár a RUO címke nem ró szabályozási terhet a gyártóra, az olyan dokumentumok, mint az ICH M10 útmutató¹ jelzik, hogy a végfelhasználónak a vizsgálatok jellegétől függően milyen szigorral kell eljárnia. A kutatások e spektrumának kezeléséhez olyan vizsgálatot kell előállítani, amely magas fokú ellenőrzésnek is ellenáll, és amely minden kutató számára a polcról elérhető. Ezt szem előtt tartva vállaljuk a kritikus reagensek részletes értékelését és a szigorú R&;D tesztelést, mindezt szigorú minőségbiztosítási eljárások alkalmazásával. Olvasson tovább, hogy megismerje a Conferma^® ELISA módszer minden egyes lépésének részleteit.

• Hogyan működik a Conferma^® ELISA
• Kritikus reagensek ellenőrzése
• Assay Testing Principles & Techniques
• Lot-to-Lot Consistency Testing
• Lot-to-Lot konzisztencia vizsgálata
• Conferma^® ELISA termékek

Hogyan Conferma^®< ELISA-ok működése

A Conferma^® ELISA-ok a szendvics ELISA formátumot követik. A szendvics-ELISA egy általános enzimhez kötött immunszorbens próba (ELISA) eljárás, amely egy minta antigénszintjét méri, és összehasonlítja egy hasonló célpont ismert szintjének válaszával, amelyet általában sorozatosan hígítva egy standard görbévé alakítanak. Az antigén két antitest, a befogadó antitest és a kimutató antitest közé van "szendvicsbe zárva". Ezek az antitestek lehetnek poliklonális antitestek vagy, mint a Conferma^® ELISA-ink esetében, monoklonális antitestek (mAbs). A szendvics ELISA-kat az egyik legérzékenyebb és legspecifikusabb ELISA-típusnak tekintik a biomarkerek elemzésére szolgáló antitestek kimutatására, mivel két egyedi epitópra van szükség annak megállapításához, hogy a megfelelő fehérjét azonosították-e. A 2. ábra mutatja be e Conferma^® tesztek működését.

2. ábra. Hogyan működnek a Conferma^® ELISA-k. A Conferma^® ELISA-k a biomarkerek mérésére szolgáló antitestek kimutatására szendvics ELISA-módszert alkalmaznak. Ennek során a befogadó antitestet előzetesen bevonják egy 96 lyukú lemezre, hozzáadják a célpontot tartalmazó mintát és a standardot. A biotin-jelölt detektáló antitestek hozzáadása a lyukakhoz és a torma-peroxidázzal (HRP)-streptavidinnel történő inkubálás befejezi a szendvicset, és jelet ad a koncentráció meghatározásához.

Kritikus reagensek ellenőrzése

AConferma^® kritikus reagenseket, a monoklonális antitesteket és a rekombináns kalibráló fehérjéket (standard/QC) házon belül állítjuk elő kiválósági központjainkban Kaliforniában, az Egyesült Államokban és Izraelben. Kiterjedt tesztelés igazolja a reagensek hasonlóságát és teljesítményét. A kalibrátorfehérjék például nagyon hasonlítanak az UniProtban közzétett érett szekvenciákhoz, és a vizsgálat mAb-jei nagy affinitással rendelkeznek irántuk.

A Conferma^® kritikus reagensek tesztelésére a következő fiziokémiai technikákat alkalmazzuk:

• Masszaspektrometria (LC-MS/MS & RP-LC-UV-MS, 3. ábra és 1. táblázat): A fehérje szekvenciájának megadása és a mért tömeg meghatározása
• SPR (Surface Plasmon Resonance, 2. táblázat): Megerősíti a nagy affinitást (K_D <0.5 nM) minden egyes mAb-nek a standardhoz
• AAA (Aminosav-analízis): Arany standard a fehérjekoncentrációhoz 

3. ábra. LC-MS/MS elemzés. Két tétel IL-6 Conferma^® ELISA kalibrátor anyag szekvencia-lefedettsége LC-MS analízis alapján. A kék kiemelés az IL-6 azonosított szekvenciáit mutatja.

1. táblázat. RP-LC-UV-MS elemzés. Az IL-6 Conferma^® ELISA reagens tételenkénti eredmények (kalibrátor és mAbs) összehasonlítása a biotin-konjugált detektáló antitest tömegének (Da) és molonkénti megoszlásának alapján. A korrigált szekvencia és az intakt tömegadatok összehasonlítása alátámasztja, hogy a szekvencia megegyezik az UniProt accession # P05231, AA30-212 jelentett szekvenciával.

Minta	Mért tömeg (Da)
Kalibrátor tétel 028M4878V	20,977
Kalibrátor tétel 015M4836V	20,977
Kapszula mAb IL6.2F2 (tétel RB1811028)	148,728
Capture mAb IL6.2F2 (tétel RB1812003)	148,735
Capture mAb IL6.2F2 (tétel RB1912001)	148,728
Kimutatás mAb IL6.2E3 (tétel RB1811029)	148,937
Kimutatás mAb IL6.2E3 (tétel RB1812002)	148,934
Kimutatás mAb IL6.2E3 (tétel RB1912002)	148,933

2. táblázat. SPR elemzés. Példa az MCP-1 Conferma^® ELISA tétel-specifikus befogadó és detektáló mAb-okra, amelyeket SPR (Biacore™ T-200 rendszer) segítségével (a befogadó mAb-hez való biotinilálás előtt és után) elemeztek affinitás szempontjából. A <0,5 nM K_D érték nagy affinitást jelez. Bt = biotinilált.

mAb	mAb tétel	Kalibrátor tétel	KD< (nM)
MCP-1 Capture	RB1811009	046M4767V	0.031
MCP-1 Capture	RB1907012	046M4767V	0.023
MCP-1 detektálás	RB1811010	046M4767V	0.061
MCP-1 kimutatás	RB1907014	046M4767V	0.053
MCP-1 Capture Bt	RB1811010	046M4767V	0.089
MCP-1 Capture Bt	RB1910009	046M4767V	0.072

Assay tesztelés alapelvei és technikái

Assay megvalósíthatósági tesztelése meghatározza azokat a működési paramétereket, amelyeket egy assay-nek mind házon belül, mind a tudós kezében teljesítenie kell. Az ajánlott tesztek jól dokumentáltak^1-4, például az ICH M10 útmutatóban,¹ és ezek közül sokat a Conferma^® ELISA-k tesztelése során is alkalmazunk (3. táblázat). A tesztelés teljes listája megtalálható az egyes tesztek hitelesítési jelentésében. Példa tesztelési adatok a 4. ábrán láthatók.

3. táblázat. Vizsgálatok és paraméterek. A Conferma^® ELISA tesztek vizsgálati technikáinak magyarázata.

Teszt	Módszer	Paraméter megállapítva
Szenzitivitás	A standard görbe legalacsonyabb pontja % CV & % Recovery <20%.	LLOQ/érzékenység.
Mintapárhuzamosság	Hígított mátrixok, nagy mennyiségű endogén fehérjével. Visszaszámítás a tiszta értékre.		% Linearitás, jelzi a mátrix interferenciát.
Hígítási linearitás	Mátrix hígítási sorozata a rekombináns fehérje ismert értékével. Visszaszámítás a tiszta értékre.		% Linearitás, jelzi a mátrix interferenciát.
Recovery		Mátrix szúrása több ismert rekombináns fehérje értékkel. Számítsa vissza a tiszta értékre.		% Recovery, jelzi az esetleges mátrixinterferenciát.
Intra-Assay CV		Futtasson több mintaismétlést egyetlen lemezen.		% CV, jelzi a lemezen lévő kutak közötti eltérést.
Inter-Assay CV		Futtasson több mintaismétlést több lemezen több felhasználó által.	% CV, a lemezek közötti eltérést jelzi.
Keresztreaktivitás		A társított rekombináns fehérjék magas tüskéi egy mátrixban.	Nincs keresztreaktivitás, amelyet a <az Assay LLOQ O.D. 20%-a jelez.
Endogén mintatartomány	Natív minták futtatása, normál és beteg körülmények között.		Az assay endogén dinamikai tartományát jelzi.
Mátrix / Mintavétel	Ellenőrizze a mintaidő és a mintavétel módját.	A vizsgálathoz megfelelő mátrix.
Minták korrelációja	Az azonos minták lefuttatása mindkét vizsgálaton.	R2 lineáris korrelációt jelez.

4. ábra. Példa a vizsgálati adatokra. (A.) Mintapárhuzamossági példa a Conferma^® MCP-1 ELISA teszthez. Öt endogén szérumminta magas célfehérje-szintekkel hígítva és visszaszámolva az eredeti értékre. (B.) Minta-visszanyerési vizsgálati példa a Conferma^® TNF-α ELISA teszthez. Öt humán szérummintát három ismert mennyiségű rekombináns fehérjével spicceltünk. A visszanyerés tartományban és átlagértékben van kifejezve (pl. TNF-α szérum = 85%-105%, átlag = 95%).

Lot-to-Lot konzisztencia

Az ELISA-k kulcsfontosságú részét képezik egy laboratórium kísérleti stratégiájának, mind az ismételt, egyszeri felhasználás, mind a folyamatban lévő longitudinális vizsgálatok részeként. Mindkét esetben kulcsfontosságú szempont, hogy a vizsgálat hosszú távon következetesen működjön. A Conferma^® ELISA-k a kit gyártása előtt tételről tételre történő kritikus reagensvizsgálattal, a kész kit megerősítésével egy belső referencia standarddal szemben, valamint egy endogén mintahíddal kezdődnek, az adatokat pedig hosszú távú trenddiagramokban rögzítik (4. táblázat). E vizsgálatból származó adatpéldákat az 1B. ábra (standardgörbe összehasonlítás/paralelizmus) és az 5. táblázat (mintatétel-tétel közötti áthidalás) mutatja be.

4. táblázat. Vizsgálati információk a tételek közötti konzisztencia megerősítésére. A Conferma^® ELISA-készletek kritikus reagensekre, standardokra, minőségellenőrzésekre és minta áthidalására vonatkozó vizsgálati elvek részletei.

Tesztelés	Információk
Kritikus reagensek		Tisztaság, mért tömeg és KD (nM)
Standard		Standard görbe párhuzamosság és jel (O.D.)
Minőségi ellenőrzések	Három QC trenddiagramja, az elfogadás az alapérték 2 SD-n belül van
Végleges megerősítés, a minták 80%-a az eredetileg meghatározott érték 15%-án belül van

5. táblázat. Mintatelek közötti áthidalás. Az IL-6 Conferma^® ELISA tétel áthidalása. 15 endogén minta aliquotálása és vizsgálata a tételek között. A 80%-nak az előző tétel és az eredeti érték +/- 15%-ának kell lennie. *Az eredmények a 15%-os tartományon kívül vannak.

IL-6										Analyst	/th>	1	2	3	1	1	th>2	3	4
Minta	Mear	Median	STDEV	%CV	th>UCL(+2SD)	LCL(-2SD)	14-Sep-20	28-Jul-20	/th>	27-Jul-20	14-Sep-20	28-Jul-20		27-Jul-20	25-Jun-21
S1	17.67	18.76	1.88	0.11	20.32	15.02	15.50	18.70	18.80	15.47	18.62	18.76	19.10
S2	29.87	31.40	4.48	0.15	34.35	25.39	27.10	31.10	31.40	27.17	30.99	31.46	33.50
S3	27.36	28.58	4.10	0.15	31.46	23.25	25.60	28.70	27.80	25.63	28.58	27.84	30.80
S4	12.20	12.38	1.83	0.15	14.03	10.37	11.40	12.40	12.80	11.40	12.38	12.83	12.20
S5	10.67	10.80	1.60	0.15	12.27	9.07	10.10	10.80	11.10	10.12	10.84	11.07	10.70
S6	31.35	30.20	4.70	0.15	36.05	26.65	28.80	30.20	35.00	28.81	30.14	35.15	30.50
S7	5.66	6.03	0.85	0.15	6.50	4.81	*4.30	*6.60	6.10	*4.26	*6.65	6.03	5.20
S8	2.86	3.00	0.43	0.15	3.29	2.43	3.10	3.00	2.50	3.06	3.06	2.46	2.60
S9	12.28	12.50	1.84	0.15	14.13	10.44	11.50	12.50	13.20	11.48	12.24	12.79	*14.30
S10	10.61	10.70	1.59	0.15	12.21	9.02	10.70	11.20	10.00	10.67	11.16	9.95	11.70
S11	22.59	23.00	3.39	0.15	25.97	19.20	21.10	23.00	23.70	21.13	22.93	23.67	25.60
S12	3.57	3.29	0.53	0.15	4.10	3.03	3.10	*4.30	3.30	3.04	*4.37	3.29	3.20
S13	20.49	20.81	3.07	0.15	23.56	17.41	19.70	21.00	20.80	19.72	20.90	20.81	23.30
S14	6.23	6.30	0.93	0.15	7.16	5.30	6.30	6.50	6.00	6.22	6.42	5.94	*7.60
S15	6.62	6.70	0.99	0.15	7.62	5.63	6.10	7.10	6.70	6.01	7.13	6.70	*8.40
									Eredmény	Passz		Passz	Passz	Passz	Passz	Megfelel	Pass	Pass

Conferma^® ELISA termékek<onferma^®/h2>

A Conferma^® ELISA-kat úgy tervezték és tesztelték, hogy tételről tételre erős mintadetektálást és dinamikus tartományt biztosítsanak. Az ennek eléréséhez használt módszerek és protokollok az iparágban jelenleg alkalmazott legmodernebbek közé tartoznak. Az eredmény olyan tesztek, amelyeket úgy terveztek, hogy eredményesek legyenek.

Minden teszthez két kulcsfontosságú dokumentum tartozik, egy, a tesztelési folyamatot részletező ellenőrzési jelentés és egy tétel-specifikus analitikai tanúsítvány, amelyek az alább linkelt termékoldalakon találhatók. Az egyes ELISA-próbák protokolljait is megtalálja ezeken az oldalakon.

Megnézheti ezt a webináriumot is, hogy megtudjon többet a Conferma^® ELISA folyamat mögött álló részletekről.

Kizárólag kutatási célra. Nem használható diagnosztikai eljárásokban.

Hivatkozások/További olvasmányok

1. 2019. ICH M10 on bioanalytical method validation - Scientific guideline. [Internet]. European Medicines Agency: EMA. Available from: https://www.ema.europa.eu/en/ich-m10-bioanalytical-method-validation-scientific-guideline

2. Piccoli S, Sauer J, Ackermann B, Lilly E, Allinson J, Arnold M, Amur S, Fda U, Aubrecht J, Baker A. 2019. Points to Consider Document: Scientific and Regulatory Considerations for the Analytical Validation of Assays Used in the Qualification of Biomarkers in Biological Matrices Biomarker Assay Collaborative Evidentiary Considerations Writing Group. [Internet]. Critical Path Institute (C-Path): Available from: https://c-path.org/wp-content/uploads/2019/06/evidconsid-whitepaper-analyticalsectionv2019.pdf

3. O’Hara DM, Theobald V, Egan AC, Usansky J, Krishna M, TerWee J, Maia M, Spriggs FP, Kenney J, Safavi A, et al. 2012. Ligand Binding Assays in the 21st Century Laboratory: Recommendations for Characterization and Supply of Critical Reagents. AAPS J. 14(2):316-328. https://doi.org/10.1208/s12248-012-9334-9

4. King LE, Farley E, Imazato M, Keefe J, Khan M, Ma M, Pihl KS, Sriraman P. 2014. Ligand Binding Assay Critical Reagents and Their Stability: Recommendations and Best Practices from the Global Bioanalysis Consortium Harmonization Team. AAPS J. 16(3):504-515. https://doi.org/10.1208/s12248-014-9583-x