Úvod do SDS-PAGE - separace proteinů na základě velikosti

Polyakrylamidové gely vznikají reakcí akrylamidu a bis-akrylamidu (N,N'-methylenbisakrylamidu), jejímž výsledkem je vysoce zesíťovaná gelová matrice. Gel funguje jako síto, kterým se proteiny pohybují v reakci na elektrické pole. Proteiny obsahují celkový kladný nebo záporný náboj; to umožňuje pohyb molekuly proteinu směrem k izoelektrickému bodu, v němž molekula nemá čistý náboj. Denaturací bílkovin a jejich jednotným záporným nábojem je možné je při migraci směrem ke kladné elektrodě oddělit na základě velikosti.

Obrázek 1. SDS-PAGE proteinových vzorků a barevný proteinový marker(C1992)

Protokol

Potřebný materiál a činidla

• Vertikální elektroforézní komora se zdrojem napájení, skleněné destičky, distanční podložky a hřebeny

Potřebné reagencie	Složky v činidle	Číslo výrobku
Roztok akrylamidu/bis-akrylamidu	Akrylamid 29.2 g Bis-akrylamid 0.8 g	01696 Přídavek k potravinám, např.M7279
Pufry pro odlévání gelu	1.5 M Tris-HCl, pH 8,8 (pro přípravu rozlišovacího gelu): Rozpusťte 18.15 g báze Tris v 80 ml destilované vody. Upravte pH na 8,8 pomocí 6N HCl. Doplňte konečný objem destilovanou vodou na 100 ml. 0,5 M Tris-HCl, pH 6.8 (pro přípravu stohovacího gelu): Rozpusťte 6 g báze Tris v 80 ml destilované vody. Upravte pH na 6,8 pomocí 6N HCl. Doplňte konečný objem destilovanou vodou na 100 ml.	93362
2X Laemmliho nakládací pufr	Bromfenolová modř 0.004% 2-merkaptoethanol 10% Glycerol 20% SDS 4% Tris-HCl 0.125 M	B5525 M3148 G5516 L3771 93362
10x běžící pufr	Tris-HCl 25 mM Glycin 200 mM SDS 0.1% (w/v)	93362 G8898 L3771
10% SDS	SDS	L3771
10% Persiřičitan amonný	Odst.Persíran amonný	A3678
TEMED	TEMED	T9281

Poznámka: Akrylamid a bis-akrylamid jsou neurotoxické. Všechny kroky by měly být prováděny v rukavicích, které neobsahují prášek.

Příprava gelu

• Skleněné destičky a distanční podložky jednotky pro odlévání gelu očistěte deionizovanou vodou a etanolem.
• Sestavte destičky s distančními podložkami na stabilní, rovný povrch.
• Připravte roztok rozlišovacího gelu pomocí následujících objemů (pro 10 ml) v závislosti na požadovaném procentu gelu.

Gel %	Voda (ml)	30% akrylamid (ml)	1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 (ml)	10% SDS (µl)	10% APS (µL)	TEMED*(µL)
8%	4.6	2,6	2.6	100	100	10
10%	3.8	3,4	2.6	100	100	10
12%	3.2	4,0	2.6	100	100	10
15%	2.2	5,0	2.6	100	100	10

• Nalijte roztok gelu do destiček sestavených s distančními podložkami. Pro udržení rovnoměrného a vodorovného povrchu rozlišovacího gelu překryjte povrch vodou nebo isopropanolem (I9516).
  
• Nechte gel při pokojové teplotě asi 20-30 min ztuhnout.
  
• Připravte roztok stohovacího gelu pomocí následujících objemů (pro 10 ml):
  

Gel %	Voda (ml)	30% akrylamid (ml)	0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 (ml)	10% SDS (µl)	10% APS (µL)	TEMED*(µL)
5%	5.86	1,34	2.6	100	100	10

*TEMED musí být poslední přidanou složkou

• Odstraňte překrytou vodu nebo isopropanol na rozlišovacím gelu
• Přidávejte 5% roztok stohovacího gelu, dokud nepřetéká. Okamžitě vložte hřeben a ujistěte se, že v gelu nebo v blízkosti jamek nejsou zachyceny žádné vzduchové bubliny.
• Nechte gel při pokojové teplotě asi 20-30 min. ztuhnout.
  

Příprava vzorku

• K objemu proteinového vzorku (buněčný nebo tkáňový lyzát) přidejte stejný objem nakládacího pufru.
  
• Vařte výše uvedenou směs při 95 °C po dobu 5 min. Odstřeďujte při 16000 xg po dobu 5 min.
  
• Tyto vzorky lze uchovávat při -20 °C nebo je lze použít k pokračování gelové elektroforézy.

Barvení gelů

Barvení modrou Coomassieho barvou: Barvení proteinových gelů modrou Coomassie Brilliant Blue R-250 je běžný postup pro vizualizaci proteinů rozdělených pomocí SDS-PAGE. Je vysoce citlivý a vhodný pro dlouhodobé skladování gelů.

Potřebné činidla

• Roztok pro fixaci gelů (500 ml)
  
        Methanol (M3641) 250 mL
       Kyselina ledová octová (695092) 50 ml
      Voda 200 ml
  
  
• Roztok Coomassie
  
       CBB R-250 (B6529) 0.1%
       Methanol (M3641) 40%
       Kyselina ledová octová (695092) 10%
       Roztok mořidla přefiltrujte pomocí Whatmann No. 1 filtračního papíru.
  
  
• Destain solution
  
       Methanol (Přidejte k roztoku.M3641) 50 ml
       Kyselina ledová octová (#695092) 35 ml
  
  
• Roztok pro skladování gelů
  
       Kyselina ledová octová (695092) 25 ml
        Voda 475 ml

Postup

• Po elektroforéze umístěte gel do plastové vaničky obsahující roztok pro fixaci gelu. Umístěte vaničku na houpací stůl a fixujte proteiny po dobu 2 hodin.
  
• Odstraňte roztok pro fixaci gelu a přidejte roztok Coomassie.  Umístěte na houpací stůl a barvěte gel po dobu 2-4 hodin.
  
• Po skončení kroku barvení gel několikrát promyjte destilovanou vodou, abyste odstranili přebytečné barvivo.
  
• Přidejte do gelu roztok destain. Umístěte na kývací stůl a destainujte po dobu asi 4 hodin, dokud nebudou viditelné jasné modré pruhy na čirém pozadí.
  
• Po destainaci lze gely uložit do roztoku pro uchovávání gelů a podle potřeby fotografovat.

Barvení stříbrem

Nabízíme vysoce citlivou sadu pro barvení stříbrem pro detekci proteinů vhodnou pro gely SDS-PAGE. Dále jsou zapotřebí následující činidla:

• Fixační roztok
  
      . Etanol (E7023) 50 ml
        Kyselina octová 10 ml
       Voda 40 ml
  
  
• 30% ethanol (E7023) roztok

Postup

• Po elektroforetickém běhu ponořte gel do fixačního roztoku na 40 min. Noční ponoření do fixačního roztoku vytvoří jasnější pozadí.
  
• Odstraňte fixační roztok a promývejte gel po dobu 10 min 30% roztokem ethanolu a následně promývejte ultračistou vodou po dobu 10 min.
  
• Vypusťte vodu a inkubujte gel v roztoku senzibilizátoru po dobu 10 min.
  
• Odstraňte roztok senzibilizátoru a promyjte gel dvakrát vodou, přičemž každé promytí trvá 10 min.
  
• Vylijte vodu a ponořte gel na 10 min do roztoku stříbra.
  
• Vylijte roztok stříbra a promývejte gel ve vodě po dobu 1,5 min.
  
• Vylijte vodu a ponořte gel na 3 až 7 min do vývojkového roztoku.
  
• Přidejte 5 ml stop roztoku do vývojkového roztoku a inkubujte 5 min. Odstraňte vývojku/stop roztok a gel promývejte v ultračisté vodě po dobu 15 min.
  
• Gel lze vyfotografovat a také uchovávat v čerstvé, ultračisté vodě.

Pro dvojí barvení obarvěte gel pomocí CBB R-250 a následně stříbrným barvením podle výše uvedených postupů.

Fluorescenční barvení: Nabízíme fluorescenční barviva SYPRO a Lucy pro elektroforézu proteinů. Gely lze buď ponořit do fluorescenčního barviva ve tmě, nebo gel během elektroforézy smíchat s katodovým pufrem.

Protokoly barvení závisí na použitém barvivu a najdete je zde:

• SYPRO^® Ruby Protein Gel Stain (PDF)
  
• LUCY^® 506 Solution (PDF)
  

Oboustranné barvení gelu

Reverzibilní barvení gelu umožňuje uživateli přejít k western blottingu proteinů po SDS-PAGE.

Barvení R-PROB: R-PROB je jedinečné barvivo, které detekuje proteiny na gelech PAGE a western blotech.

Reagents Required:

• Sada pro reverzibilní detekci proteinů na membránách a polyakrylamidových gelech (RPROB)
  
• Fixační roztok/a> (F7264)
  
• 10% kyselina octová
  
• EDTA 50 mM

Postup

• Gely po elektroforéze ponoříme na 20 minut do fixačního roztoku. Tento krok opakujte dvakrát.
  
• Gel dvakrát propláchněte ve vodě, každé promytí trvá 30 min.
  
• Gel inkubujte v barvicím roztoku 20-40 min. za mírného míchání.
  
• Přebytečné barvivo smyjte v 10% kyselině octové.
  
• Pro odbarvení gel promyjte EDTA a následně dvakrát po 15 minutách ve vodě nebo fixačním roztoku.

Barvení mědí: Pro potvrzení migrace a separace proteinů lze gel obarvit reverzibilním barvivem, například CuCl₂.

Potřebná činidla

• 0,3 M roztok CuCl₂ 
  
• 0.25 M roztok Tris a 0,25 M roztok EDTA

Postup

• Gely po elektroforéze oplachujte v destilované vodě po dobu maximálně 30 min.
  
• Namočte gel do 0,3 M roztoku CuCl₂ na 10 min.
  
• Opláchněte deionizovanou vodou.
  
• Bílkoviny lze vizualizovat jako čiré zóny na modrém pozadí.
  
• Pro úplné odbarvení gelu pro western blot promyjte obarvené gely v 0.25 M Tris a 0,25 M roztoku EDTA, pH 9, opakovaně.
  
• Před pokračováním v nastavení přenosu přeneste destainovaný gel do přenosového pufru.

Obrázek 2. Systém pro blotování a vertikální elektroforézu

Pokud si přejete přenést proteiny na membránu po elektroforéze, najdete protokol zde.

Produkty

Litujeme, vyskytla se neočekávaná chyba.

Network error: Failed to fetch

Odkaz

1. Sambrook J, Fritsch T, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.