Srážkové postupy

Srážení proteinů je volitelným krokem při přípravě vzorků pro 2-D elektroforézu. Srážení, po němž následuje resuspenze v roztoku vzorku, se obvykle používá k selektivnímu oddělení proteinů ve vzorku od kontaminujících druhů, jako jsou soli, detergenty, nukleové kyseliny, lipidy atd., které by jinak narušily výsledek 2-D analýzy. Srážení s následnou resuspenzí lze také použít k přípravě koncentrovaného vzorku bílkovin ze zředěného zdroje (např. rostlinných tkání, moči). Všimněte si však, že žádná technika srážení není zcela účinná a některé proteiny se po srážení nemusí snadno resuspendovat. Použití srážecího kroku během přípravy vzorku tak může změnit proteinový profil vzorku. Pokud je nejdůležitější úplné a přesné zastoupení všech proteinů ve vzorku, je třeba se srážení a resuspenzi vyhnout.

2-D Clean-Up Kit od společnosti Cytiva lze použít k odstranění kontaminujících látek a zlepšení vzoru 2-D elektroforézy. Proteiny jsou vysráženy kombinací srážecích činidel, zatímco rušivé látky, jako jsou nukleové kyseliny, soli, lipidy nebo detergenty, zůstávají v roztoku. Vzorky lze resuspendovat v požadovaném denaturačním roztoku pro IEF. Každá sada může zpracovat 50 vzorků po 100 µl. Oddíl 1.4.1 (Cleaning up samples using 2-D Clean-Up Kit) popisuje soupravu a uvádí protokol použití.

Tabulka 8 uvádí některé techniky srážení, které lze použít. Pokud příprava vzorku vyžaduje srážení, obvykle se použije pouze jedna technika srážení.

Tabulka 8. Srážkové postupy.

Precipitační metoda	Obecný postup	Omezení
Srážení síranem amonným ("vysolování") V přítomnosti vysokých koncentrací solí mají bílkoviny tendenci agregovat a vysrážet se z roztoku. Mnoho potenciálních kontaminantů (např. nukleové kyseliny) zůstane v roztoku.	Připravte protein tak, aby konečná koncentrace roztoku proteinu byla > 1 mg/ml v pufrovacím roztoku, který má > 50 mM a obsahuje EDTA. Pomalu přidávejte síran amonný na požadované procento nasycení (44) a míchejte 10-30 min. Proteiny se peletují centrifugací.	Mnoho proteinů zůstává rozpustných při vysokých koncentracích solí, proto se tato metoda nedoporučuje, pokud je požadováno celkové zastoupení proteinů. Tuto metodu však lze použít pro prefrakcionaci nebo obohacení. Zbytkový síran amonný bude interferovat s IEF a musí být odstraněn (45). Viz oddíl 1.5 o odstranění solí (Desalting samples using Mini Dialysis Kit).
Srážení TCA TCA (kyselina trichloroctová) je velmi účinným srážedlem bílkovin.	TCA se přidá k extraktu na konečnou koncentraci 10-20 % a proteiny se nechají srážet na ledu po dobu 30 minut (46). Alternativně lze tkáň homogenizovat přímo do 10-20% TCA (35, 47) Tento přístup omezuje proteolýzu a další modifikace proteinů. Odstřeďte a promyjte pelety acetonem nebo ethanolem, abyste odstranili zbytky TCA.	Proteiny se mohou obtížně resolubilizovat a nemusí se resolubilizovat úplně. Zbytky TCA je třeba odstranit rozsáhlým promytím acetonem nebo ethanolem. Delší působení tohoto roztoku s nízkým pH může způsobit určitou degradaci nebo modifikaci bílkovin.
Srážení acetonem Toto organické rozpouštědlo se běžně používá k vysrážení proteinů. Mnoho organicky rozpustných kontaminantů (např. detergenty, lipidy) zůstane v roztoku.	Přidejte k extraktu nejméně tři objemy ledově chladného acetonu. Nechte proteiny vysrážet při -20 °C po dobu nejméně 2 h. Proteiny peletujte centrifugací (46, 48-50). Zbytkový aceton se odstraní sušením na vzduchu nebo lyofilizací.	Neúplné získání všech proteinů. Problémem může být kompatibilita acetonu se zkumavkami.
Precipitace pomocí TCA v acetonu Kombinace TCA a acetonu se běžně používá k precipitaci proteinů při přípravě vzorků pro 2-D elektroforézu a je účinnější než samotná TCA nebo aceton.	Suspendujte lyzovaný nebo rozrušený vzorek v 10% TCA v acetonu buď s 0,07% 2-merkaptoetanolem nebo 20 mM DTT. Precipitujte proteiny po dobu nejméně 45 min při -20 °C. Proteiny peletovat centrifugací a pelety promýt studeným acetonem obsahujícím buď 0,07% 2-merkaptoethanol, nebo 20 mM DTT. Zbytky acetonu odstraňte sušením na vzduchu nebo lyofilizací (5, 28, 34, 43, 51, 52).	Proteiny se mohou obtížně resolubilizovat a nemusí se resolubilizovat úplně. Prodloužené působení tohoto roztoku s nízkým pH může způsobit určitou degradaci nebo modifikaci proteinů.
Recyklace octanem amonným v methanolu po fenolové extrakci Tato technika se ukázala jako užitečná u rostlinných vzorků obsahujících vysoké množství rušivých látek.	Proteiny ve vzorku se extrahují do vodou nebo pufrem nasyceného fenolu. Proteiny se z fenolové fáze vysráží 0,1 M octanem amonným v methanolu. Pelet se několikrát promyje octanem amonným v methanolu a poté acetonem. Zbytkový aceton se odpaří (42, 43, 47, 53).	Metoda je složitá a časově náročná