Příprava vzorků a řešení problémů s gelovou elektroforézou

Elektrický proud, dráty, vodiče, hřebeny, netěsnosti... tolik příležitostí k potížím. Přesto gely používáme, protože elektroforéza zůstává účinným způsobem separace proteinů - takže výsledky imunodetekce založené na protilátkách mohou být poměrně jednoznačné.

Klikněte na témata Příprava vzorků &; Gelová elektroforéza a přečtěte si o možných příčinách a nápravách:

• No Bands or Gel Front
  
• Vzorek neklesá na dno studny
  
• Vzorek uniká ze studny
  
• Vzorek je rozmazán vertikálně
  
• Příliš mnoho pásů
  
• Gel běží neobvykle pomalu
  
• Gel běží neobvykle rychle
  
• Proteinové pásy příliš blízko u sebe (ne zcela vyřešeno)
• Nejvíce vlevo a/nebo nejvíce vpravo zkreslené pásy gelu
  
• Pásma tvoří usměvavé tvary

Žádné pásky nebo gelové přední části

Možná příčina	Náprava
Proteiny z gelu vyprchaly	Snižte dobu, po kterou gel běží. Snižte napětí. Ujistěte se, že jsou přívody správně orientovány, protože elektroforetické přívody ke zdroji napájení mohou být obrácené, což způsobí, že gel vyběhne nahoru. Zvyšte procento akrylamidu v gelu.
Na gel nebylo vloženo dostatečné množství proteinu	Vložte do každé jamky více proteinu. Ujistěte se, že koncentrace bílkovin v každém vzorku je přesná.
Vzorek se před použitím napájení rozptýlil z jamky<./td>	Zkráťte dobu mezi vložením první jamky gelu a zahájením elektroforézy. V případě potřeby spusťte méně gelů a/nebo méně drah najednou.
Ve vzorku není dostatek SDS	Bez dostatečného množství SDS nejsou proteiny negativně nabité a neprojdou buňkou. Zajistěte dostatečnou koncentraci SDS.

Vzorek neklesá na dno studny

Možná příčina	Náprava
Nedostatek glycerolu ve vzorku	Zvýšit koncentraci glycerolu.

Vzorek vytékající ze studny

Možná příčina	Náprava
Jamky poškozené při odstraňování hřebínku	Hřebínek na gel odstraňujte opatrně, aby nedošlo k narušení jamek. Před vložením vzorku jamky jemně propláchněte elektroforézním pufrem, abyste odhalili poškozené jamky.
Jamky poškozené při vkládání vzorku	Vkládejte vzorek opatrně a dbejte na to, aby se špička pipety nedotkla dna nebo stran jamek.

Pásy jsou rozmazané ve svislém směru

Možná příčina	Náprava
Neúplná rozpustnost bílkovin blokuje vstup bílkovin do gelu	Při přípravě buněčného lyzátu zajistěte dostatečnou sonikaci/homogenizaci a odstředění, aby se odstranily pevné částice.
Degradace proteinů	Při přípravě buněčného lyzátu přidejte/zvyšte koncentraci inhibitorů proteáz/fosfatáz. Vyhněte se opakovaným cyklům zmrazování/rozmrazování vzorků buněčného lyzátu a Western blotu.
Příliš mnoho načteného proteinu Vliv zatížení SDS-PAGE příliš příliš velkého množství bílkovin na SDS-PAGE (pravý krajní pruh)	Snižte množství bílkovin vložených do jamky. Zajistěte přesnou koncentraci bílkovin ve vzorku.
Gel běží příliš rychle	Zvýšit dobu běhu gelu.
Nekvalitní nebo starý gel	Použijte čerstvý gel.

Příliš mnoho kapel

Možná příčina	Náprava
Degradace bílkovin	Při přípravě buněčného lyzátu přidejte/zvyšte koncentraci inhibitorů proteázy/fosfatázy. Vyhněte se opakovaným cyklům zmrazování/rozmrazování vzorků buněčného lyzátu a Western blotu.
Agregace proteinů	Zajistěte odpovídající koncentraci DTT, který snižuje disulfidové vazby. Vzorky pro Western blot před naložením na gel zahřejte ve vodní lázni.

Gel běží neobvykle pomalu

Možná příčina	Náprava
Příliš koncentrované pufry	Rozřeďte pufry.
Příliš nízký proud	Zvýšit napětí gelového přístroje.

Nezvykle rychlý běh gelu

Možná příčina	Náprava
Příliš zředěné pufry	Koncentrujte pufry.
Příliš vysoký proud	Snižte napětí gelového přístroje.

Příliš blízké proteinové pásy (ne zcela vyřešené)

Možná příčina	Náprava
Nedostatečná doba běhu	Zapněte gel na delší dobu.
Nesprávná velikost pórů gelu	Použijte gradientní gel (vyšší procento akrylamidu na spodní straně než na horní), který dostatečně rozliší širší rozsah velikostí proteinů.

Nejlevější a/nebo nejpravější pásy gelu jsou zkreslené

Možná příčina	Napravení
Nenechávejte prázdné studny. Nepoužívané jamky zatěžujte malým množstvím bílkovin, abyste zabránili okrajovým efektům na sousední dráhy.

Kapely tvoří usměvavé tvary

Možná příčina	Náprava
Nadměrné teplo Gelový běh se "usmívá." To je způsobeno příliš vysokým napětím. Také cílové pásy jsou vybělené, což je způsobeno použitím detekčního činidla s příliš vysokou koncentrací.	Zaběhněte gel při nižším napětí na delší dobu. Používejte chlazené pufry a gel provozujte v chladné místnosti nebo zabalený v ledu.