Domů Gelová elektroforézaTechnologie bis-tris-polyakrylamidové gelové elektroforézy

Technologie bis-tris-polyakrylamidové gelové elektroforézy

Technologie gelů Bis-Tris nabízí ve srovnání s tradičními akrylamidovými gely pro aplikace SDS-PAGE řadu výhod, včetně rychlejšího průběhu a ostřejšího rozlišení pásů.

Chemie polyakrylamidových gelů
Technologie gelů Bis-Tris
Srovnání pufrů Tris-Glycin a Bis-Tris
mPAGE^® Bis-Tris prefabrikované gely pro elektroforézu proteinů
mPAGE^® TurboMix Bis-Tris Gel Casting Kit

Vyžádat si vzorek

Polyakrylamidový gel Chemie

PAGE používá diskontinuální pufrovací systém, ve kterém se iont gelového pufru liší od iontů běžícího pufru. Rozdíl v elektroforetické pohyblivosti těchto dvou iontů vytváří pohyblivý gradient napětí, kterým proteiny procházejí. Nejpoužívanějším systémem PAGE je gelová chemie Tris-Glycin, která používá gely složené z Tris-HCl a běžící pufr složený z tris báze a glycinu. Tris-glycinové gely pracují ve vysoce alkalickém prostředí, které může vést k nežádoucím modifikacím proteinů, jako je deaminace a alkylace. V důsledku toho mohou být proteinové pásy v gelech Tris-Glycin deformovány nebo ztrácet rozlišení.

Bis-Tris gelová technologie

Bis-Tris gely naopak používají Bis-Tris a HCl v gelovém pufru a MOPS nebo MES v běhovém pufru. Gely Bis-Tris pracují při neutrálním pH, což minimalizuje modifikaci proteinů a podporuje stabilitu proteinů během běhu gelu. Toto neutrální pH vede k ostřejšímu rozlišení a přesnosti proteinových pásů. Gely Bis-Tris mají také delší skladovatelnost než gely Tris-Glycin, které časem začínají hydrolyzovat. Gely Bis-Tris lze flexibilně kombinovat s běžícím pufrem na bázi MOPS nebo MES; rozdíl v migraci mezi těmito dvěma ionty vede k rozdílným rozsahům separace proteinů. MES by se měl používat, pokud je protein, který vás zajímá, malý (<50 kDa), zatímco MOPS by se měl používat k rozlišení proteinů střední až velké velikosti.

Vlastnosti a výhody gelové technologie Bis-Tris.

Obrázek 1.Vlastnosti a výhody technologie Bis-Tris ve srovnání s tradičními gely Tris-Glycin

Ve srovnání s tris-glycinovými gely jsou v Bis-Tris gelech pozorovány ostřejší pásy.

Obrázek 2.Srovnání gelů Tris-Glycin (vlevo) a Bis-Tris (vpravo). Gely Tris-Glycin a Bis-Tris byly ručně odlity 12% akrylamidem a ponechány polymerovat přes noc. Gely byly zatíženy identickými titry lyzátu E. coli (pruhy 3-6), standardem nebarveného proteinu mPAGE^® (pruhy 2 a 7) a standardem barevného proteinu mPAGE^® (pruh 1). Gely byly spuštěny buď v Tris-Glycinovém, nebo MOPS pufru, obarveny proteinovým barvivem ReadyBlue™ po dobu jedné hodiny a destainovány deionizovanou vodou po dobu jedné hodiny.

Srovnání pufrů tris-glycin a bis-tris

Při přípravě proteinů je také důležité zvážit typ použitého pufru. U gelů Tris-Glycin se obvykle používá Laemmliho pufr, který denaturuje a obaluje proteiny záporně nabitými ionty SDS. Vzorky se pak vaří při teplotě 100 °C, aby se usnadnila denaturace. Zahřátí Laemmliho pufru na 100 °C způsobí, že pH se stane vysoce kyselým. Bylo prokázáno, že kombinace tepla a kyselosti způsobuje štěpení proteinů, přednostně na peptidových vazbách Asp-Pro¹. Toto štěpení vede ke zjevným produktům degradace bílkovin během elektroforézy. Naproti tomu gely Bis-Tris používají pufr pro vzorky LDS, který během přípravy vzorku udržuje zásadité pH a nevyžaduje zahřátí nad 70 °C k úplné denaturaci proteinů. Tato příprava zachovává integritu bílkovin minimalizací štěpení peptidových vazeb Asp-Pro.

Tabulka 1.Srovnání chemického složení gelů Tris-Glycin a Bis-Tris. Gelové roztoky Bis-Tris se dodávají ve dvou variantách, které vyhoví potřebám každého výzkumníka: mPAGE^® Bis-Tris Precast Gels a mPAGE^® TurboMix Bis-Tris Gel Casting Kit.
Chemie gelů Tris-glycin a Bis-Tris PAGE

mPAGE^® Bis-Tris prefabrikované gely pro elektroforézu proteinů

Gelový systém mPAGE^® Bis-Tris SDS-PAGE nabízí vysoký výkon, optimální elektroforetickou separaci a lepší rozlišení v širokém rozsahu molekulových hmotností. Prefabrikované gely mPAGE^® Bis-Tris mají univerzální konstrukci, která umožňuje vkládat větší objemy vzorků. Díky formátu minikazety 10 x 8 cm jsou gely mPAGE^® Bis-Tris Precast Gels kompatibilní s nejoblíbenějším zařízením pro gelovou elektroforézu.

mPAGE^® Bis-Tris Precast Gels jsou navrženy tak, aby pracovaly výhradně s běžícím pufrem MOPS nebo MES. V závislosti na tom, který provozní pufr se použije, lze dosáhnout velmi odlišných separačních vzorů. Pufr MOPS lze použít k jemnému doladění separace velkých a středně velkých proteinů, zatímco pufr MES poskytuje optimální separaci menších proteinů. Podle migračních grafů (obrázky 3-7) určete, který systém gelového pufru je nejvhodnější pro zamýšlený rozsah separace.

Migrační diagram proteinů pro chemické gely Bis-Tris a Tris-Glycin. Graf zobrazuje migraci pro 8 % gelů: mPAGE Bis-Tris precast gel s MOPS & MES Running Buffer, mPAGE LUX Bis-Tris handcast gel s MOPS a MES Running Buffer, mPAGE TurboMix handcast gel s MOPS a MES Running Buffer a Tris-Glycin handcast gel s Tris-Glycin Running Buffer. Pro lepší separaci v oblasti vyšších molekulových hmotností se používají nižší procenta gelu, například 8 %. Separaci proteinů na Bis-Tris gelech lze dále optimalizovat použitím MES nebo MOPS běhového pufru. Pro separaci proteinů se střední a vysokou molekulovou hmotností se upřednostňuje pufr MOPS, zatímco pufr MES má výhody pro separaci proteinů se střední a nízkou molekulovou hmotností.

Obrázek 3.Migrační grafy 8% mPAGE^® Bis-Tris & Tris-Glycin Gel Chemistry molekulové hmotnosti zobrazené v kilodaltonu (kDa).

Migrační diagram proteinů pro chemické gely Bis-Tris a Tris-Glycin. Graf zobrazuje migraci pro 10% gely: mPAGE Bis-Tris precast gel s MOPS & MES Running Buffer, mPAGE LUX Bis-Tris handcast gel s MOPS a MES Running Buffer, mPAGE TurboMix handcast gel s MOPS a MES Running Buffer a Tris-Glycin handcast gel s Tris-Glycin Running Buffer. Pro širokou separaci v celém molekulárním rozsahu se používá střední procento gelu, například 10 a 12 %. Separace proteinů na Bis-Tris gelech může být dále optimalizována použitím MES nebo MOPS pufru. Pro separaci proteinů se střední a vysokou molekulovou hmotností se upřednostňuje pufr MOPS, zatímco pufr MES má výhody pro separaci proteinů se střední a nízkou molekulovou hmotností.

Obrázek 4.Migrační grafy 10% mPAGE^® Bis-Tris a Tris-Glycin gelových chemikálií.

Migrační diagram proteinů pro chemické gely Bis-Tris a Tris-Glycin. Graf zobrazuje migraci pro 12 % gely: mPAGE Bis-Tris precast gel s MOPS & MES Running Buffer, mPAGE LUX Bis-Tris handcast gel s MOPS a MES Running Buffer, mPAGE TurboMix handcast gel s MOPS a MES Running Buffer a Tris-Glycin handcast gel s Tris-Glycin Running Buffer. Pro širokou separaci v celém molekulárním rozsahu se používá střední procento gelu, například 10 a 12 %. Separace proteinů na Bis-Tris gelech může být dále optimalizována použitím MES nebo MOPS pufru. Pro separaci proteinů se střední a vysokou molekulovou hmotností se upřednostňuje pufr MOPS, zatímco pufr MES má výhody pro separaci proteinů se střední a nízkou molekulovou hmotností.

Obrázek 5.Migrační grafy 12% mPAGE^® Bis-Tris a Tris-Glycin gelových chemikálií.

Migrační diagram proteinů pro 13,5% mPAGE LUX Bis-Tris gel. Graf zobrazuje migraci pro MOPS a MES Running Buffer. Pro lepší separaci nízkomolekulárních proteinů se používají vyšší procenta gelu, například 13,5 %. Separaci proteinů na gelu Bis-Tris lze dále optimalizovat použitím běhového pufru MES nebo MOPS. Pro separaci proteinů se střední a vysokou molekulovou hmotností se upřednostňuje pufr MOPS, zatímco pufr MES má výhody pro separaci proteinů se střední a nízkou molekulovou hmotností.

Obrázek 6.Migrační grafy 13,5% mPAGE^® Lux Bis-Tris gelu s pufry MOPS a MES.

Migrace proteinů z 15% mPAGE TurboMix Bis-Tris gelu s ručním odlitkem s MOPS a MES Running Bufferem zobrazená na grafu: Proteiny separované pomocí MOPS pufru oproti MES pufru obvykle migrují dále do gelu při stejném chemickém složení gelu. Vyšší procento gelu, jako je 15 %, se používá pro lepší separaci při nižších molekulových hmotnostech. Separace proteinů na Bis-Tris gelech může být dále optimalizována použitím MES nebo MOPS pufru. Pro separaci proteinů se střední a vysokou molekulovou hmotností se upřednostňuje pufr MOPS, zatímco pufr MES má výhody pro separaci proteinů se střední a nízkou molekulovou hmotností.

Obrázek 7.Migrační grafy 15% mPAGE^® gelu TurboMix Bis-Tris s pufry MOPS a MES.

mPAGE^® TurboMix Souprava pro odlévání gelu Bis-Tris

Souprava pro odlévání gelu mPAGE^® TurboMix Bis-Tris se skládá z Rozpouštěcího roztoku a Stahovacího roztoku. Roztoky jsou optimalizovány tak, aby zjednodušily kroky přípravy gelu a minimalizovaly odpad činidel. Roztoky mPAGE^® TurboMix lze použít při tradičních metodách odlévání nebo při postupu Quick Cast (obrázek 8).

Postup Quick Cast polymerizuje v jednom kroku nalitím stohovacího gelu bezprostředně po rozpouštěcím gelu. Roztok mPAGE^® TurboMix Resolving Solution se dodává s 20% podílem akrylamidu a je formulován pro ředění deionizovanou vodou, což umožňuje flexibilitu při odlévání různých podílů resolvingového gelu. Roztok mPAGE^® TurboMix Stacking Solution se dodává se 4% podílem akrylamidu a vyžaduje pouze přidání persíranu amonného (APS) a N,N,N',N'-tetramethylethan-1,2-diaminu (TEMED). Další zdroje pro gelovou elektroforézu proteinů naleznete na naší stránce aplikace gelové elektroforézy, kde naleznete všechna potřebná činidla a protokoly pro rozlišení proteinů.

Obrázek 8.Metoda mPAGE^® TurboMix Quick Cast nabízí rychlý, pětistupňový proces lití polyakrylamidových gelů.

Materiály

Odkaz

Robinson DR, Watts NR, Coombs DH. 1988. Heat cleavage of bacteriophage T4 gene 23 product produces two peptides previously identified as head proteins. J Virol. 62(5):1723-1729. https://doi.org/10.1128/jvi.62.5.1723-1729.1988

Chcete-li pokračovat, musíte se přihlásit.

Abyste mohli pokračovat ve čtení, přihlaste se nebo vytvořte účet.

Nemáte účet?