Protokol analýzy genové exprese/počtu kopií qPCR s použitím barviva SYBR Green I

PPCR Technologies Protocols Table of Contents

Optimalizace podmínek qPCR

Optimalizace podmínek qPCR je důležitá pro vývoj robustního testu. Indikací špatné optimalizace je nedostatečná reprodukovatelnost mezi replikáty a také neúčinné a necitlivé testy. Dva hlavní přístupy jsou optimalizace koncentrace primerů a/nebo teploty žíhání. 

Měření cílové veličiny vzhledem k jednomu nebo více stabilním referenčním genům pomocí detekce barviva SYBR Green I je běžnou aplikací qPCR. Níže je uveden standardní protokol, který lze přizpůsobit specifickým experimentálním potřebám.

Cíle experimentu

Po optimalizaci testů qPCR pro cílové i referenční geny se tyto použijí k měření množství cílových genů. Stanoví se poměr mezi množstvím zájmového genu (GOI) a stabilního referenčního genu (genů), jak je popsáno v Data Analysis. V tomto příkladu je pro stanovení počtu kopií použita standardní křivka. Relativní množství však lze stanovit i bez standardní křivky pomocí alternativní metody komparativní kvantifikační analýzy (Analýza dat). Pokud se použije tento přístup, standardní křivka se vynechá, ale vedle všech testovaných vzorků se zahrne kalibrační vzorek. Standardní koncentrace primerů a teploty žíhání jsou zahrnuty v protokolu, ale měly by být upraveny na základě výsledků optimalizačních experimentů (Optimalizace koncentrace primerů a Optimalizace primerů pomocí teplotního gradientu).

Vybavení

• Přístroj pro kvantitativní PCR 
• Kryt s laminárním průtokem pro nastavení PCR (volitelný)<./li>

Reagencie

• gDNA 10ng až 100ng nebo cDNA, která se použije jako templát (ředěná 1:2 pro geny s nízkou expresí až 1:10 až 1:100 pro geny se střední až vysokou expresí).
• KiCqStart SYBR^® Green ReadyMix™ (KCQS00/KCQS01/KCQS02/KCQS03 - závisí na přístroji, viz tabulka P4-6).
• Voda třídyPCR: Voda třídy PCR (W1754 nebo W4502) jako 20ml alikvoty; zmrazte; pro každou reakci použijte čerstvý alikvot.
• Přední a zpětné primery pro testované geny (zásoba 10 μM).

Tabulka P17-42. Průvodce výběrem PCR směsi SYBR Green

Hot Start ReadyMixes (Taq, pufr, dNTPs, referenční barvivo, MgCl2)
KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™, Kat. No. KCQS00	KiCqStart® SYBR.® Green qPCR ReadyMix™ Low Rox , Kat. No. KCQS01	KiCqStart® SYBR.® Green qPCR ReadyMix™ s ROX, Kat. No. KCQS02	KiCqStart® SYBR.® Green qPCR ReadyMix™ for iQ, Kat. No. KCQS03
Compatible Instruments:	Kompatibilní přístroje:	Kompatibilní přístroje:	Kompatibilní přístroje:
Bio-Rad CFX384™	Applied Biosystems 7500	Applied Biosystems 5700	Bio-Rad CFX384™	Bio-Rad CFX384™
Bio-Rad CFX96™	Applied Biosystems 7500	Applied Biosystems 7000
Bio-Rad MiniOpticon™	Rychlý Applied Biosystems ViiA 7	Applied Biosystems 7300	Bio-Rad MyiQ™
Bio-Rad MyiQ™	Stratagene Mx3000P®	Bio-Rad MyiQ™
Bio-Rad/MJ Chromo4™	Stratagene Mx3005P™
Bio-Rad/MJ Opticon 2	Stratagene Mx4000™	Applied Biosystems 7900 HT Fast
Bio-Rad/MJ Opticon®		Applied Biosystems 7900HT
Cepheid SmartCycler®		Applied Biosystems StepOnePlus™
Eppendorf Mastercycler® ep realplex		Applied Biosystems StepOne™
Eppendorf Mastercycler® ep realplex2 s
Illumina Eco qPCR
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 3000
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 6000
Qiagen/Corbett Rotor-Gene
Roche LightCycler

Dodávky

• Sterilní filtr hroty pipet
• Sterilní 1.5 ml mikrocentrifugační zkumavky se šroubovacím uzávěrem (CLS430909)
• Zkumavky a destičky pro PCR, vyberte si takovou, která odpovídá požadovanému formátu:
  -    Jednotlivé tenkostěnné 200 μl zkumavky pro PCR (Z374873 nebo nbsp;P3114)
  -    Destičky
         - 96-well plates (Z374903)
        - 384jamkové destičky (Z374911)
  -   Těsnění destiček
         - Těsnicí fólie ThermalSeal RTS™ (Z734438)
        - ThermalSeal RT2RR™ fólie (Z722553)

Poznámky k tomuto protokolu

• CDNA se generuje pomocí náhodného primingu nebo metody oligo-dT (Standardní protokol reverzní transkripce (dvoukrokový)).
• Přední a reverzní primery zřeďte na 10 μM nebo na vhodnou koncentraci určenou na základě optimalizace (Optimalizace koncentrace primerů a Primer Optimization Using Temperature Gradient).
• Pokud používáte destičku PCR, postupujte podle schématu destičky, abyste zajistili, že reakční směs, vzorky a kontroly budou přidány do správných jamek.
• Všechny testy budou probíhat jako duplicitní reakce.

Metoda

1. V případě, že se jedná o reakci, která se opakuje, je třeba provést analýzu.    Připravte si jinou qPCR master směs pro každý pár primerů, který má být proveden. Připravte dostatečné množství směsi pro vzorky, standardní
       reakce s křivkou (popsané níže jako šest ředění), kontroly bez templátu, vše ve dvou kopiích, plus započítejte dalších 10 % pro
       zohlednění chyby pipetování.

       Například pokud je pět testovaných vzorků, připravte směs pro vzorky (5×.2) plus standardní křivka (6×2) plus žádná šablona
       kontrola (NTC) (1×2) = 24 reakcí. Proto připravte směs pro 26,4 nebo 27 reakcí na jeden pár primerů.

Tabulka P17-43. Reakční směs pro detekci SYBR Green I

Reagencie	Objem (μl) na jednu 20 μl reakci<./th>
2× KiCqStart SYBR Green qPCR ReadyMix	10
Premiér vpřed (10 μM)	0.9
Reverzní primer (10 μM)	0.9
Voda pro PCR	3,2

2.      Připravte si sériové ředění vhodného templátu standardní křivky/cDNA v poměru 1:10 (nebo vhodném ředění pro daný experiment) tak, abyste měli v každém ředění 20 μl templátu (celkem šest ředění).

3.     Přidejte 5 μl příslušného sériového ředění templátu (standardní křivka), testovacího vzorku cDNA nebo vody (NTC) do definovaných
     zkumavek nebo jamek.

4.      Do každé zkumavky nebo jamky přidejte 15 μl master mixu.

5.      Uzavřete zkumavky nebo uzavřete destičku PCR a označte ji. (Ujistěte se, že označení nezakrývá dráhu světla excitačního/
    detekčního přístroje.)

6.     Proveďte vzorky podle tabulky P17-44.

 

Tabulka P17-44. Podmínky cyklování PCR pro generování standardní křivky

Cyklické podmínky	Teplota (°C)	Čas (s)
Denaturace/horký start	95	30
Krok 1	95	5
Krok 2	60	30

Poznámka: Použijte standardní protokol disociační křivky (sběr dat).