Protokol pro konjugaci NHS-esterových modifikací s aminoznačenými oligonukleotidy

Tento protokol slouží ke konjugaci NHS-esterových modifikací, jako je TxRd (Sulforhodamin 101-X) (protokol je účinný pro většinu NHS-esterových modifikací), s oligonukleotidem s amino značkou, jako je 5'-Amino-Modifikátor C6 (obrázek 1). Protože TxRd (Sulforhodamin 101-X) a několik dalších modifikací je k dispozici pouze jako NHS estery, musí se ručně konjugovat s aminoznačenými oligonukleotidy v samostatné post-syntetické reakci.

Obrázek 1. Příklad post-syntetické NHS-esterové modifikační reakce s TxRd (Sulforhodamin 101-X) a oligonukleotidem 5'-Amino-Modifier C6.

Definice / zkratky

• DMSO - Dimethylsulfoxid
• EtOH
/b> - etanol
• HCl - kyselina chlorovodíková
• NaCl - Chlorid sodný
• NaB - Dekahydrát tetraboritanu sodného (Na₂B₄O<.sub>7 ּ- 10H₂O)

Přístroje

• Laboratorní třepačka/li>
• Chladicí odstředivka (Eppendorf™ 5810R nebo ekvivalentní)
• Lyofilizátor nebo odstředivá odparka (pro sušení bez použití vzduchu)

Příslušenství

• 1 ml injekční stříkačka
• jehla o průměru 20 mm
• 2 ml odstředivkové zkumavky
• 50 ml centrifugační zkumavky (volitelné)
• Hroty pro pipety
• Pipety na jedno použití
• NaB (produkt č. S9640)
• Milli-Q^® H₂O
• HCl (koncentrovaná)
• 100% EtOH (výrobek č. 2) (např. E7023-4L) při -70 °C
• 70% EtOH při -20 °C
• 3M pufr s octanem sodným (č. výrobku:   
• 3M pufr s octanem sodným (č. S7899-1L)
• Modifikace NHS-esteru dle výběru
• 5'-amino-modifikátor C6 oligonukleotid s vlastní sekvencí

Metoda

Proces konjugace je rozdělen do dvou hlavních kroků: 1) konjugační reakce a 2) odstranění přebytečné, volné NHS-esterové modifikace srážením po konjugaci.

Ačkoliv je HPLC konvenční metodou odstranění přebytečné, volné NHS-esterové modifikace a nespojeného oligonukleotidu, mohou být účinné i jiné purifikační postupy, např. srážení. Srážením (popsaným níže) se odstraní většina, ale ne všechny zbývající NHS-esterové modifikace. V závislosti na aplikaci může být problémem nekonjugovaná modifikace. I když nebude dále reagovat, protože NHS-ester je hydrolyzován pufrem, může přispívat k šumu pozadí, a proto vést ke špatnému poměru S:N (pokud je modifikace barvivem, např. TxRd (Sulforhodamin 101-X), nebo snížit hustotu povrchového zatížení (pokud modifikace slouží k navázání, např. biotin). Navíc zůstane nespojený oligonukleotid.

Konjugační reakce

Začněte s doporučenými podmínkami a podle potřeby je optimalizujte. 

1. Před použitím se ujistěte, že jsou všechna činidla rozmražena, důkladně promíchána a odstředěna.  
2. Rozpusťte aminoznačený oligonukleotid v konjugačním pufru, jako je NaB pH 8,5, podle pokynů v Tabulce 1. Konečná koncentrace oligonukleotidu bude mezi 0,3 a 0,8 mM. Příprava 50 ml 0,091 M pufru NaB je popsána v Doplňkových poznámkách.
3. Modifikaci NHS-esteru rozpusťte v DMSO. Koncentrace NHS-esterové modifikace je přibližně 14 mM (může se lišit v důsledku proměnlivé molekulové hmotnosti modifikace). Viz Další poznámky k přípravě NHS-esterových modifikací.
4. Přidejte doporučený objem NHS-esterové modifikace k doporučenému objemu aminoznačeného oligonukleotidu podle pokynů v Tabulce 1. Zkumavku jemně promíchejte. Uvedené objemy se vejdou do zkumavky o objemu 2 ml. Pro reakce většího rozsahu použijte buď více zkumavek o objemu 2 ml, nebo zkumavku o objemu 50 ml.
5. Třepejte zkumavku (zkumavky) 2 hodiny při pokojové teplotě (přibližně 25 °C). Vhodně nastavte rychlost třepačky, aby nedocházelo k rozstřiku po stěně zkumavky. Abyste ochránili barviva před fotobělením, zakryjte zkumavku (zkumavky) hliníkovou fólií.

Tabulka 1 Konjugační referenční příručka.

Kvantita aminoznačených oligonukleotidů	Objem konjugačního pufru pro NaB	Objem modifikačního roztoku NHS-esterů	Objem etohu / octanu sodného pro precipitaci
<30 OD	200 µl	50 µl	1 ml
>30 až 60 OD	600 µL	100 µL	2 ml

Srážení po konjugaci

Srážení po konjugaci se provádí ve zkumavce o objemu 2 ml (50 ml zkumavka pro větší rozsah reakce). Dbejte na ochranu barviv před fotoběhem.

1. Doplňte objem roztoku EtOH / 3M octanu sodného (9:1 V/V) do objemu konjugační reakce podle pokynů v tabulce 1. V případě, že se jedná o konjugační reakci, přidejte roztok EtOH / 3M octanu sodného (9:1 V/V). Roztok vířivě promíchejte, abyste zahájili srážení. Roztok EtOH / 3M octanu sodného by měl být připraven čerstvý (použitelný po dobu jednoho týdne) za použití absolutního EtOH.
2. Vytáčejte zkumavku po dobu 20 minut při 4 °C. Použijte 3 000 otáček za minutu v případě centrifugy typu Eppendorf 5810R nebo 13 000 otáček za minutu v případě mikrocentrifugy.
3. K odstranění supernatantu použijte jednorázovou pipetu. Nedovolte, aby se peleta uvolnila ze dna zkumavky.
4. Přidejte 500 µl studeného 70% EtOH (-20 °C) a opatrně otáčejte kolem dna zkumavky. Nevrtejte (peleta by měla zůstat neporušená).
5. Centrifugujte 20 min při 4 °C s použitím nastavení otáček za minutu z kroku 2.
6. K odstranění supernatantu použijte jednorázovou pipetu.
7. Pokud je to žádoucí, proveďte druhé promývání EtOH (kroky 4-6).
8. Osušte vzduchem, lyofilizací nebo odstředivým odpařením.

Oligonukleotid je nyní konjugován s modifikací a může být rozpuštěn ve vodě nebo pufru pro použití v zamýšlené aplikaci.

Další poznámky

Příprava 50 ml 0.091 M pufru NaB

1. Rozpusťte 1,735 g NaB v přibližně 45 ml Milli-Q H₂O.
2. Před úpravou pH na 8,5 pomocí HCl nechte prášek zcela rozpustit. Snižte pH přidáním HCl v dávkách po 50 μl. Roztok důkladně promíchejte a poté odpipetujte přibližně 25 μl na pH proužek. Nenamáčejte pH proužek přímo do roztoku.
3. Přidávejte Milli-Q H₂O, dokud roztok nebude mít objem 50 ml. Roztok znovu promíchejte.
4. Přelijte 1 ml roztoku do 2 ml zkumavek až do vyčerpání. Zkumavky skladujte při -20 °C, aby se minimalizovala změna pH.

Jiné neaminové pufry lze nahradit NaB, pokud pH není vyšší než 8,5 (vyšší pH způsobí příliš rychlou hydrolyzaci NHS-esteru).

Příprava NHS-esterových modifikací

NHS-esterové modifikace se dodávají jako bezvodá činidla dodávaná v lahvičkách se vzduchotěsným uzávěrem. Před přidáním do aminoznačeného oligonukleotidového pufrovacího roztoku udržujte NHS-estery mimo dosah vlhkosti, protože rychle hydrolyzují. Použijte bezvodý DMSO nebo jiné rozpouštědlo.  

1. Modifikace NHS-esterů by měla být skladována při -20 °C. Před otevřením lahvičky se ujistěte, že je zcela rozmražená při pokojové teplotě (nepoužívejte teplo).
2. Na špičku 1 ml injekční stříkačky nasaďte jehlu o průměru 20 mm. Pomocí této stříkačky extrahujte požadovaný objem DMSO (použijte 100 µl na mg pevné látky modifikované NHS-esterem; v závislosti na modifikaci může být zapotřebí další DMSO). Použijte techniku "balónku", abyste udržovali zásobní láhev s DMSO pod tlakem dusíku a tím zabránili přístupu vlhkosti.
3. Doplňte bezvodý DMSO do láhve s modifikací NHS-esteru. Prášek rozpustíte jemným pipetováním DMSO nahoru a dolů za současného omývání stěn lahvičky. Jemně lahvičkou vířete, abyste zajistili úplné rozpuštění.
4. Modifikaci použijte ihned (skladování se nedoporučuje).