Protokol pro stanovení účinnosti qPCR

Přečtěte si o tom

• Optimalizace podmínek qPCR
• Vybavení
• .Reagencie
• Supplies
• Metody
• Související produkty

Optimalizace podmínek qPCR

Optimalizace podmínek qPCR je důležitá pro vývoj robustního testu. Indikací špatné optimalizace je nedostatečná reprodukovatelnost mezi replikáty a také neúčinné a necitlivé testy. Dva hlavní přístupy jsou optimalizace koncentrace primerů a/nebo teploty žíhání.

Po optimalizaci testu je důležité ověřit účinnost reakce. Tato informace je důležitá při podávání zpráv a porovnávání testů. V tomto ukázkovém protokolu je účinnost testu porovnávána v širokém a úzkém dynamickém rozsahu koncentrací cDNA. V praxi je běžné zvolit k testování jeden rozsah v závislosti na očekávaném rozsahu cílových hodnot ve vzorcích, takže uvedený protokol lze upravit podle požadavků experimentu. V tomto příkladu je účinnost vypočtena s použitím 10násobné i 2násobné řady ředění. Standardní křivka by měla zahrnovat očekávaný rozsah exprese pro geny zájmu Všimněte si, že proporcionalita výtěžnosti cDNA vzhledem ke vstupní RNA je při použití ReadyScript^® lineární;RT kit, takže tento experiment lze přizpůsobit RT-qPCR, pokud se používá tento systém, a to tak, že se 1) naředí RNA a provedou reakce RT a 2) poté se provede qPCR na každém z výsledných vzorků cDNA (viz Reverzní transkripce pro příklady). Toto však neplatí vždy a neplatí to pro všechny soupravy nebo protokoly reverzní transkripce. To je třeba ověřit před přizpůsobením tohoto protokolu alternativní soupravě 

Vybavení

• Přístroj pro kvantitativní PCR/li>
• Kryt s laminárním průtokem pro nastavení PCR (volitelný)

Reagenty

• DNA, která se použije jako šablona standardní křivky (např.g., cDNA, gDNA nebo syntetická šablona).
• KiCqStart SYBR^® Green ReadyMix™ (KCQS00/KCQS01/KCQS02/KCQS03
  
• Voda třídyPCR: PCR grade water (W1754 nebo W4502) jako 20 ml alikvotů; zmrazit; pro každou reakci použít čerstvý alikvot.
• Přední a zpětné primery pro testované geny (zásoba 10 μM). 

Tabulka 1. Průvodce výběrem zelené směsi SYBR^® PCR Mix™.

Hot Start ReadyMixes (Taq, pufr, dNTPs, referenční barvivo, MgCl2)
KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ (Kat. No. KCQS00)	KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ Low Rox (Kat. No. KCQS01)	KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ s ROX (Kat. No. KCQS02)	KiCqStart® SYBR.® Green qPCR ReadyMix™ for iQ (Kat. No. KCQS03)
Kompatibilní přístroje: KCQS03, KCQS03, KCQS03, KCQS03:	Kompatibilní přístroje:	Kompatibilní přístroje:	Kompatibilní přístroje:
Bio-Rad CFX384™	Applied Biosystems 7500	Applied Biosystems 5700	Bio-Rad iCycler iQ™
Bio-Rad CFX96™	Applied Biosystems 7500	Applied Biosystems 7000	Bio-Rad iQ™5
Bio-Rad MiniOpticon™	Rychlý Applied Biosystems ViiA 7	Bio-Rad MiniOpticon™	Bio-Rad MyiQ™
Bio-Rad MyiQ™	Stratagene Mx3000P®	Applied Biosystems 7700
Bio-Rad/MJ Chromo4™	Stratagene Mx3005P™	Applied Biosystems 7900
Bio-Rad/MJ Opticon 2	Stratagene Mx4000™	Applied Biosystems 7900 HT Fast
Bio-Rad/MJ Opticon®		Applied Biosystems 7900HT
Cepheid SmartCycler®		Applied Biosystems StepOnePlus™
Eppendorf Mastercycler® ep realplex		Applied Biosystems StepOne™
Eppendorf Mastercycler® ep realplex2 s
Illumina Eco qPCR
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 3000
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 6000
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® Q
Roche LightCycler® 480

Supplies

• Sterilní filtr hroty pro pipety
• Sterilní 1.Mikrozkumavky se šroubovacím uzávěrem o objemu 5 ml (CLS430909)
• Zkumavky a destičky pro PCR, vyberte si takovou, která odpovídá požadovanému formátu:
  -    Jednotlivé tenkostěnné 200 μl PCR zkumavky (Z374873)
  -    Destičky
        - 96jamkové destičky (Z374903)
        - Destičky s 96 jamkami.Destičky s 384 jamkami (Z374911)
  -    Těsnění destiček
        - Těsnicí fólie ThermalSeal RTS™ (Z734438)
        - ThermalSeal RT2RR™ Film (Z722553)

Poznámky k tomuto protokolu

• CDNA se vytváří pomocí náhodného primingu nebo metody oligo-dT (viz Standardní protokol reverzní transkripce (dvoukrokový)). Produkt RT se naředí pro přípravu standardních křivek (jako příklad jsou uvedeny křivky 1:2 a 1:10). RNA lze také naředit a z každého ředění syntetizovat cDNA pomocí soupravy ReadyScript^® nebo lze použít jednokrokový postup RT-qPCR naředěním RNA a dodržením jednokrokového postupu RT-qPCR v Protokolu reverzní transkripce (jednokrokový SYBR^® Green I Dye Detection) a Protokol reverzní transkripce (jednostupňová detekce sondy). Alternativně lze nahradit templáty DNA tak, aby očekávaný rozsah C_q byl v rozmezí C_q 15 až C_q 38.
• Každá koncentrace sériového ředění bude probíhat jako duplicitní reakce.

Metoda

1.      Připravte qPCR master mix, který postačí na 40 reakcí podle Tabulky 2. To umožňuje navíc
      zohlednit chyby pipetování, protože bude probíhat 32 reakcí (Tabulka 3).

Tabulka 2. Reakční směs pro vytvoření standardní křivky 1:2 a 1:10.

Reagencie	Objem (μl) pro 40 reakcí
2× KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™.	10	400
Přední primer (10 μM)	0.9	36
Reverzní primer (10 μM)	0.9	36
Voda pro PCR	3,2	128

2.    DNA nařeďte v sériích 1:10 a 1:2, přičemž každá série zahrnuje 7 bodů ředění (Tabulka 3, Rozložení destiček pro ředění DNA).

3.     Do definovaných jamek přidejte 5 μl příslušného ředění templátu (Tabulka 3, Rozložení destiček pro ředění DNA).

Tabulka 3. Schéma prvních čtyř sloupců 96jamkového uspořádání destiček s vyznačením umístění ředění šablon standardních křivek. Uvedené ředění je vztaženo k původnímu základnímu roztoku. Při použití umělé šablony je možné vypočítat počet kopií (vzhledem k hodnotám OD).

Rozložení destiček pro ředění DNA
Destička Sloupec	1	2	3	4	Zbytek destičky
A	1	1	1	1
B	0.1	0,1	0,5	0,5
C	0.01	0,01	0,25	0,25
D	0.001	0,001	0,125	0.125
E	0,0001	0,0001	0.0625	0,0625
F	0.00001	0,00001	0,03125	0.03125
G	0.000001	0.000001	0.015625	0.015625
H	NTC	NTC<./td>	NTC	NTC

4.    Do každé jamky přidejte 15 μl master mixu (Tabulka 3).

5.    Uzavřete zkumavky nebo uzavřete desku a označte ji. (Ujistěte se, že označení nezakrývá excitaci/detekci přístroje
     dráhu světla).

6.     Spusťte vzorky podle níže uvedeného dvoukrokového protokolu. Kroky 1-2 se opakují po 40 cyklech. Následuje
       amplifikace s analýzou standardní disociační křivky.

Tabulka 4. Podmínky cyklování PCR pro generování standardní křivky.

Cyklické podmínky	Teplota (°C)	Čas (s)
Počáteční denaturace/Horký start	95	30
Kroky 1 až 2 se opakují po 40 cyklech
Krok 1	95	5
Krok 2	60	30

Poznámka: Použijte standardní protokol disociační křivky (sběr dat).