Strategie vývoje chirálních metod pro HPLC
Abstrakt
Generický screening, který poskytuje rychlá řešení pro vývoj chirálních metod, ať už pro rutinní analytické použití, stopovou analýzu, LC/MS nebo preparativní LC, nabývá na významu. V tomto článku jsou použity jednoduché screeningové nástroje s chirálními stacionárními fázemi na bázi makrocyklických glykopeptidů k vytvoření robustních metod pro širokou škálu aplikací.
Přečtěte si více o
- Chirální HPLC
- Výsledky
- Optimalizace
- Výsledky.Reference
Chirální HPLC
Změna strategie objevování ve farmaceutickém průmyslu vedla k dřívějšímu zkoumání obecně odlišných biologických aktivit pro enantiomery chirálních molekul léčiv. Počet chirálních molekul, které procházejí procesem objevování, se v posledních několika letech enormně zvýšil; jsou také stále rozmanitější, takže přístup k vývoji chirálních metod musel zahrnovat právě ty chirální stacionární fáze (CSP), které nabízejí co nejširší rozsah použití pro rychlý a účinný screening.
Za posledních 25 nebo více let bylo vyvinuto několik stovek CSP, přičemž komerčně dostupných je přibližně 110 CSP. Nalepením nebo potažením chirálního selektoru - buď malé chirální molekuly, nebo většího polymeru, jako je například protein - na oxid křemičitý lze vyvolat různou sílu interakce pro dva enantiomery. Celulózová a amylózová fáze byly jedny z prvních a nejrozsáhlejších CSP, které byly vyvinuty, a jsou založeny na přírodních chirálních polymerech nanesených (nebo navázaných, jako u 2 fází) na oxid křemičitý; jedna z Advanced Separation Technologies' (Astec, nyní součást Sigma-Aldrich/Supelco) nových produktů, kolona PCAP ™ rovněž využívá polymerní technologii k zajištění chirální selektivity v řadě typů mobilních fází.
V polovině 90. let vyvinula společnost Astec novou řadu CSP založenou na chemické vazbě makrocyklických glykopeptidů [1], a protože mají mimořádně širokou použitelnost pro různé třídy sloučenin, včetně polárních, farmaceutický průmysl je široce přijal do svých schémat vývoje chirálních metod. Aplikace pokrývají širokou škálu od alifatických po aromatické molekuly, od malých heterocyklů po aromatické látky s velkými sloučenými kruhy, kyseliny, neutrální látky a báze, plus aminokyseliny a peptidy.
CHIROBIOTICKÉ kolony se vyrábějí kovalentním navázáním vysoce selektivního glykopeptidu na vysoce čistý oxid křemičitý v několika polohách, takže kolony jsou extrémně robustní a lze je používat v širokém rozsahu průtoků a za různých podmínek mobilní fáze. V sérii jsou čtyři CSP na bázi vankomycinu, teikoplaninu, teikoplaninového aglykonu a ristocetinu. Neexistují žádná omezení ve výběru rozpouštědel (lze použít i chlorovaná rozpouštědla), ačkoli některá z nich poskytují vyšší šanci na chirální selektivitu - jediné omezení je v obrácené fázi, kdy je použitelné rozmezí pH přibližně 3 - 7 (mírně odlišné pro každý CSP).
Pro chirální screening je nezbytné, aby bylo k dispozici několik možností mobilních fází, a to jak pro zajištění různých enantioselektivních interakcí mezi rozpuštěnou látkou a CSP, tak pro pokrytí rozsahu rozpustnosti vzorků. Síla a dostupnost těchto enantioselektivních mechanismů se bude lišit v závislosti na mobilní fázi - například π-π interakce jsou silné pouze v rozpouštědlech s normální fází, zatímco iontové interakce jsou možné pouze v reverzní fázi nebo v polárních typech mobilních fází (na bázi methanolu). Účinný screeningový systém bude zahrnovat všechny tyto typy.
CHIROBIOTICKÉ CSP se běžně používají ve čtyřech různých typech mobilních fází - polární iontový režim, polární organický režim, obrácená fáze a normální fáze. Polární iontový režim ("PIM") je jedinečný pro fáze CHIROBIOTIC pro ionizovatelné molekuly. Používá methanol s malým množstvím přidané kyseliny a zásady nebo methanol s malým množstvím (obvykle 0,1 g na 100 ml MeOH) pevné těkavé amonné soli přidané přímo do MeOH (může to být acetát, trifl uoroacetát nebo mravenčan).Obrázek 1 uvádí typický příklad v tomto režimu, oblíbeném pro svou rychlost a lepší detekci MS. Režim polární organické fáze je dalším systémem nevodné mobilní fáze, který používá jednotlivá rozpouštědla nebo jejich kombinace a je účinný na těchto CSP pro neutrální molekuly. Obrácená fáze je velmi podobná aplikacím nechirálního typu RP, kde zvýšení obsahu vody zvyšuje retenci (s výjimkou některých aplikací pro aminokyseliny, kdy je tomu naopak). Je také ideální pro metody LC/MS. A konečně normální fáze, která představuje asi 15 % všech separací, používá typické směsi hexanu nebo heptanu a alkoholu a poskytuje některé jedinečné separace. Příručka CHIROBIOTIC [2] uvádí příklady aplikací ve všech typech mobilních fází.
Obrázek 1.Separace kyseliny 2-brom-3-methylmáselné na CHIROBIOTIC R
Přechodem z jednoho typu mobilní fáze na jiný - na stejné koloně - se mění separační mechanismus, což vám dává další možnost separace; neexistují žádné paměťové efekty předchozí mobilní fáze, které by mohly ovlivnit výsledky. Naše laboratoř pro vývoj metod v průběhu let vyvinula a refi novala screeningové složení pro každý typ mobilní fáze, takže je máte k dispozici, abyste mohli velmi rychle určit, zda vám daný typ kolony a typ mobilní fáze poskytne požadovanou selektivitu. K dispozici jsou pak jednoduché optimalizační techniky pro vývoj metody tak, jak ji potřebujete (například pro detekci MS, biokatalýzu, analýzu rozpouštění nebo preparativní aplikace).
Výsledky
Cílem tohoto screeningového systému je, že dává rychlou kladnou nebo zápornou odpověď; pokud se během doby běhu objeví jediný symetrický pík - za předpokladu, že retenční čas je vyšší než 10 minut - pak tato kolona nebo tato mobilní fáze nemá správnou selektivitu. Pokud je retenční čas nižší než 10 minut, je důležité opakovat běh a trochu zředit mobilní fázi; metodu lze vždy později v rámci optimalizace urychlit. Pokud dojde k rozdělení píku nebo dokonce k mírnému ramenu, můžete postoupit k optimalizačním krokům. Při kompletním screeningu postupujete přes čtyři screeningové mobilní fáze pro každou kolonu, abyste určili nejlepší selektivitu. Nezapomeňte, že u řady CHIROBIOTIC neexistují žádné paměťové efekty, takže každou kolonu lze použít pro každý typ mobilní fáze postupně.
Optimalizace
Pro tyto sloupce jsou k dispozici jednoduché optimalizační protokoly. Zvláště snadná je manipulace s polárním iontovým režimem pomocí změn koncentrace kyselin/sedimentů nebo těkavých solí pro zvýšení selektivity a/nebo změnu retence. Normální fáze a polární organický režim používají k optimalizaci metody standardní výběr modifikátorů - například různé alkoholy; retence se jednoduše řídí polaritou rozpouštědla. Obrácená fáze používá stejné proměnné jako většina metod RP - typ a koncentraci pufru, volbu organického rozpouštědla - k zajištění nejlepší separace (obrázek 2). Kromě toho lze použít teplotu; v chirální LC se vždy používaly nižší teploty než teplota okolí, aby se výrazně zvýšila selektivita, ale u CHIROBIOTICKÝCH CSP se často používají také vyšší teploty, aby se zvýšila účinnost píku, zkrátily retenční časy nebo obrátilo pořadí eluce [3]. Tyto kolony lze používat až do teploty 50 oC bez ztráty výkonu.
Obrázek 2. Separace bupivakainu
Odkazy
Abyste mohli pokračovat ve čtení, přihlaste se nebo vytvořte účet.
Nemáte účet?