Standardní protokol reverzního přepisu

Reverzní transkripce

Reverzní transkripce (RT) je proces převodu RNA na cDNA pomocí enzymu reverzní transkriptázy a dNTP.

Krok RT může být prováděn na celkové RNA tak, že se vytvoří globální cDNA, která je reprezentativní pro všechny transkripty RNA ve vzorku (obvykle pomocí dvoukrokového protokolu), nebo v přístupu specifickém pro daný gen tak, že se na cDNA převede pouze RNA, která je předmětem zájmu (obvykle podle jednostupňového protokolu).

Následující experimenty lze použít jako základní protokoly RT, které lze upravit podle konkrétních požadavků. Obvykle se cDNA připravuje buď dvoukrokovým postupem s následným ředěním cDNA před přidáním do PCR/qPCR, nebo se připravuje jednokroková reakce, kdy se oba postupy provádějí postupně.

Vybavení

• Standardní PCR přístroj nebo topný blok
• Kryt s laminárním prouděním pro nastavení RT (volitelný)

Reagencie

• RNA (zásobní roztok přibližně 1 μg/μl).
• Souprava pro dvoufázovou syntézu cDNA (RDRT) ReadyScript^® 
• Připravená souprava pro dvoufázovou syntézu cDNA (RDRT). Ve spojení s oligo-dT primery a/nebo náhodnými primery lze použít i alternativní soupravy pro reverzní transkripci.
• Voda třídy PCR: Voda třídy PCR (W1754 nebo W4502) jako 20 ml alikvotů; zmrazte; pro každou reakci použijte čerstvý alikvot.

Příslušenství

• Sterilní filtr hroty pipet
• Sterilní 1.Mikrozkumavky se šroubovacím uzávěrem o objemu 5 ml (CLS430909)
• Zkumavky a destičky pro PCR, vyberte si takovou, která odpovídá požadovanému formátu:
  - Jednotlivé tenkostěnné 200 μl PCR zkumavky (Z374873 nebo P3114)
  - Destičky
    - 96jamkové destičky (Z374903)
    - 384jamkové destičky (Z374911)
  - Těsnění nebo uzávěry destiček
    - Těsnicí fólie ThermalSeal RTS™ (Z734438)
    - Těsnicí fólie ThermalSeal RTS™ (Z734438)
  nbsp;- Fólie ThermalSeal RT2RR™ (Z722553)

Metoda

Příprava

1. Složky soupravy ReadyScript^® a vzorky RNA uložte na led.
2. Smíchejte a poté krátce odstřeďte, aby se obsah shromáždil na dně zkumavky.

Reakce

1. Určete počet potřebných reakcí včetně kontrol. Vypočítejte objemy jednotlivých složek potřebné pro všechny reakce (připočtěte 10 % navíc pro chyby při pipetování) a kombinujte činidla podle tabulky P10-26 s použitím 0,2 ml zkumavek nebo 96jamkové destičky umístěné na ledu. Pokud používáte destičku PCR, postupujte podle schématu destičky, abyste se ujistili, že jsou činidla přidána do správných jamek.

Tabulka P10-26. ReadyScript^® cDNA Synthesis Reaction Master Mix

Reagent	Objem (μl) na jednu 20 μl reakci
ReadyScript®cDNA Synthesis Mix (5× RT blend)	4
Celková šablona RNA - proměnná (1 μg až 10 pg)	/td>	1
Voda třídyPCR	15

2. Po uzavření každé reakce jemně promíchejte obsah. Krátce odstřeďte, abyste shromáždili složky na dně reakční zkumavky.
3. Inkubujte reakční směs podle Tabulky P10-27.

Tabulka P10-27. Teplotní inkubační profil reakce syntézy cDNA ReadyScript^®

Doporučujeme.Teplota (°C)	Čas (min)
25	5
42	30
85	5
4	Podrženo

4. Po dokončení syntézy cDNA použijte 1:5 až 1:10 reakce prvního řetězce (2-4 μl) pro amplifikaci PCR.  
   Poznámka: při použití činidel ReadyScript^® lze do PCR přidat 2-4 μl neředěné cDNA, aniž by došlo k inhibici. V případě potřeby lze produkt cDNA naředit 10 mM Tris- HCl (pH 8,0), 0,1 mM EDTA a uchovávat při -20 °C.