Protokoly kvantitativní PCR
Ačkoli kvantitativní PCR využívá stejný základní koncept jako tradiční PCR, reakce se liší tím, že amplikony jsou obvykle menší a jsou detekovány nepřímo pomocí dalšího barviva nebo značené sondy či primeru.
V Průvodci technologiemi PCR byly podrobně popsány potřebné komponenty a požadavky na kontrolu kvality pro experimenty qPCR. S ohledem na ně je níže uveden protokol, který lze použít jako základní šablonu pro qPCR obsahující barvivo SYBR Green I vázající DNA, který je možné upravit a použít jako validaci pro sadu primerů. Optimalizace koncentrace primerů a teploty žíhání pomocí barviva SYBR Green I jsou podrobněji popsány v Optimalizaci koncentrace primerů a Optimalizaci primerů pomocí teplotního gradientu.
Vybavení
- Pipety dávkující objemy od <1 do 200 μl
- Stolní mikrocentrifuga
- Přístroj pro kvantitativní PCR
- Kryt s laminárním průtokem pro nastavení PCR (volitelný)
Příslušenství
- Šablona DNA/cDNA: Reakce s prvním vláknem cDNA zředěná v poměru 1:10 pro detekci středně až vysoce exprimovaných cílů nebo 1:2 až 1:5 pro vzácné transkripty. 10 ng až 100 ng gDNA.
- KiCqStart® SYBR® Green ReadyMix™ (<.a href="/product/sigma/KCQS00">KCQS00/KCQS01/KCQS02/KCQS03 - v závislosti na přístroji nebo alternativní reakční směsi qPCR SYBR Green, viz tabulky pro výběr qPCR (tabulky P4-6A, P4-6B a P4-7).
- Voda třídyPCR: Voda pro PCR (W1754 nebo W4502) jako 20ml alikvoty; zmrazte; pro každou reakci použijte čerstvý alikvot.
- Primery pro přímý a zpětný chod naředěné na pracovní koncentraci (pracovní zásoby 10 μM):
- Vlastní oligos lze objednat zde.
- K dispozici jsou také předpřipravené primery pro expresi genů pro modelové organismy (KiCqStart® SYBR® Zelené primery, KSPQ12012).
- Sterilní filtr hroty pro pipety
- Sterilní 1.5 ml šroubovací mikrocentrifugační zkumavky (CLS430909)
- PCR zkumavky a destičky, vyberte si takovou, která odpovídá požadovanému formátu:<(Z374873 nebo P3114)
- Destičky
- 96jamkové destičky (použití pro destičky s 96 jamkami).Z374903)
- 384jamkové desky (Z374911)
- Těsnění destiček
- Těsnicí fólie ThermalSeal RTS™ (Z734438)
- Fólie ThermalSeal RT2RR™ (Z722553)
Metoda
Testy prováděné v KiCqStart ReadyMix jsou optimální při použití vyšší koncentrace primerů než při konvenční PCR. V níže uvedených protokolech je použita konečná koncentrace 450 nM. Bylo zjištěno, že tato koncentrace je optimální pro několik nezávislých testů.
1. Umístěte všechny složky reakce na led.
2. Vložte všechny složky reakce na led. Smíchejte a krátce odstřeďte, aby se obsah shromáždil na dně zkumavky.
3. Připravte dostatečné množství master mixu pro provedení všech vzorků ve dvou opakováních.
a. Zahrňte duplikáty negativních kontrol bez šablony (NTC).
b. Vypočítejte množství reagencií, které je třeba smíchat. Přidejte 10 % objemu, abyste zohlednili chybu pipetování.
c. Dobře promíchejte, aby nevznikaly bubliny.
4. Nastavení reakcí:
a. Pro reakce NTC přidejte do reakčních zkumavek 5 μl vody.
b. Pro experimentální reakce přidejte do reakčních zkumavek 5 μl roztoku cDNA/gDNA.
c. Přidejte 5 μl roztoku cDNA/gDNA. Vizuálně zkontrolujte, zda všechny zkumavky nebo jamky obsahují vzorek na dně ve správném objemu.
d. Opatrně alikvotujte 15 μl reakční master směsi do každé qPCR zkumavky nebo jamky destičky.
e. Uzavřete zkumavky nebo utěsněte PCR destičku a označte ji (podle požadavků přístroje). (Ujistěte se, že označení nezakrývá
dráhu excitačního/detekčního světla přístroje.)
f. Reakce dobře promíchejte a v případě potřeby roztočte.
5. Reakce se v případě potřeby roztočí. Spusťte vzorky podle protokolu cyklování v Tabulce P4-9 a opakujte průběh kroků 1-3 po dobu 40 cyklů.
(Poznámka: Tyto podmínky jsou specifické pro cyklické protokoly FAST).
Poznámka: Použijte standardní protokol disociační křivky (sběr dat)
6. Pokyny pro analýzu dat naleznete v příručce k přístroji qPCR a Analýza dat
Abyste mohli pokračovat ve čtení, přihlaste se nebo vytvořte účet.
Nemáte účet?