Rychlá a přesná LC-MS analýza metabolitů vitaminu D pomocí HPLC kolon Ascentis^® Express F5

Craig R. Aurand, David S. Bell

Reporter US Volume 29.2

Úvod

Deficit vitaminu D se v posledních publikacích stal předmětem zájmu.^1-3 Vitamin D spolu s vápníkem podporuje správný růst kostí u dětí a pomáhá v prevenci osteoporózy u starších osob. Vitamin D se vyskytuje ve dvou formách, a to vitamin D3 a vitamin D₂. D₃ vzniká po přeměně 7-dehydrocholesterolu stimulované ultrafialovým zářením v kůži.³ Vitamin D₂ pochází z rostlinných zdrojů. Jak D₂ tak D₃ jsou metabolizovány v játrech za vzniku 25-hydroxyvitaminu D₂ a v játrech se tvoří 25-hydroxyvitamin D₂ -./sub> (25-OH D₂) a 25-hydroxyvitaminu D₃ (25-OH D₃). Kromě toho byly hlášeny biologicky neaktivní 3-epi analogy 25-OH D₂ a 25-OH D₃ zejména u malých dětí.³ Hladiny 25-hydroxy metabolitů se rutinně měří pro diagnostické posouzení onemocnění souvisejících s vitaminem D; nedávné studie však naznačily, že oddělení od neaktivních 3-epi analogů může poskytnout přesnější informace pro léčbu a prevenci. Analytické metody, které mohou přesně kvantifikovat oba analyty 25-hydroxyvitaminu D v přítomnosti analogů 3-epi, se mohou stát nezbytnými pro diagnostiku a sledování pacientů s poruchami vitaminu D.

Obrázek 1. Struktura 25-hydroxy metabolitu vitaminu D

Vitamin D3 se vytváří v kůži po vystavení slunečnímu záření.

HPLC analýza 25-OH D₂ a 25-OH D₃ se klasicky provádí pomocí stacionárních fází C18. Za takových podmínek nejsou analogy 3-epi rozlišeny, a proto jsou zahrnuty do celkové uváděné hodnoty. Nedávno Phinney, et al. uvedl použití kyano sloupce pro účinnou separaci 25-OH a 3-epi forem pro použití v referenčních postupech měření.¹ Ačkoli je účinná, podmínky vyžadují dobu běhu lepší než 40 minut, což omezuje její použitelnost pro rutinní vysoce výkonné analýzy.

Výsledkem některých nedávných snah o vývoj aplikací bylo zjištěno, že pentafluorofenylová (PFP, Ascentis Express F5) stacionární fáze poskytuje zvýšenou selektivitu vůči 25-OH D₃ a odpovídajícímu 3-epi analogu oproti uváděným metodám. Tato zpráva obsahuje stručný přehled pokračujícího úsilí o posouzení potenciálního dopadu této dodatečné selektivity na rutinní klinickou diagnostiku vitaminu D.

Diskuse

Struktury analytů vitaminu D jsou znázorněny na obrázku 1, přičemž počáteční separace 25-OH D je znázorněna na obrázku 2.sub>3 a 3-epi-25-OH D₃ pomocí fluorované fáze je znázorněno na obrázku 2. Separace ukazuje, že selektivity mezi analogy lze dosáhnout za méně než 10 minut, zatímco separace s použitím kyanové kolony vyžadovala téměř 40 minut.

Konečným cílem této separace bude pravděpodobně použití hmotnostní spektrometrie k dosažení požadované úrovně kvantifikace a specifity. S ohledem na to byly přijaty výchozí podmínky pro rychlou metodiku LC-MS. Obrázek 3 ukazuje některé předběžné výsledky, které naznačují, že 25-OH D₃ a 3-epi-25-OH D₃ lze rychle rozlišit. 25-OH D₂ a 3-epi-25-OH D₃ koelují za těchto vysoce průchodných podmínek, avšak jsou snadno rozlišitelné pomocí hmotnostní odezvy. Metodika tak umožňuje kvantifikaci všech tří složek v jedné analýze.

column:	Ascentis Express F5, 10 cm x 3,0 mm I.D., 2.7 μm (53578-U)
mobilní fáze:	voda:methanol (28:78, v/v)
temp.:	30 °C
průtoková rychlost:	0,5 ml/min.
zpětný tlak:	3100 psi
detekce:	MS, APCI (+), režim SIR, m/z 401
vzorek:	20 μg/ml v methanolu
injekce:	2 μl

Obrázek 2. Separace 25-hydroxyvitaminu D3 a 3-epi 25-hydroxyvitaminu D3 pomocí Ascentis Express F5

column:	Ascentis Express F5, 10 cm x 2,1 mm I.D., 2.7 μm (53569-U)
mobilní fáze:	25% 5mM mravenčan amonný voda, 75% 5mM mravenčan amonný methanol
průtoková rychlost:	0.4 ml/min.
teplota.:	40 °C
objem:	1 μl
UV detekce:	265 nm
Detekce pomocí SMS:	m/z 100-1000
injekce:	2 μl

1.	25-Hydroxyvitamin D3	2,57 min
2.	3-epi-25-Hydroxyvitamin D3	2,76 min
3.	25-hydroxyvitamin D2	2,77 min

Obrázek 3. Rychlá LC-MS analýza metabolitů vitaminu D pomocí Ascentis Express F5

Závěry

Separace biologicky neaktivního analogu 3-epi může sloužit k získání lepších údajů na podporu klinické diagnostiky a léčby související s vitaminem D. Bylo prokázáno, že pentafluorofenylová stacionární fáze poskytuje vynikající selektivitu pro separaci blízce příbuzných 25-OH D₃ a 3-epi-25-OH D₃ ve srovnání s metodami uváděnými v literatuře. Počáteční snahy o prokázání selektivity v rychlém systému LC-MS poskytují slibné důkazy pro implementaci v reálných situacích. Vzhledem k tomu, že nízká hmotnostní odezva analytu a interference z matric vzorků mohou představovat další problémy při analýze, probíhají v současné době práce na dalším zkoumání chromatografických postupů i postupů přípravy vzorků ve snaze optimalizovat rychlost i citlivost.

Odkazy

1. Tai SS, Bedner M, Phinney KW. 2010. Development of a Candidate Reference Measurement Procedure for the Determination of 25-Hydroxyvitamin D3and 25-Hydroxyvitamin D2in Human Serum Using Isotope-Dilution Liquid Chromatography?Tandem Mass Spectrometry. Anal. Chem.. 82(5):1942-1948. https://doi.org/10.1021/ac9026862

2. Higashi T, Homma S, Iwata H, Shimada K. 2002. Characterization of urinary metabolites of vitamin D3 in man under physiological conditions using liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 29(5):947-955. https://doi.org/10.1016/s0731-7085(02)00135-8

3. Higashi T, Shimada K, Toyo?oka T. 2010. Advances in determination of vitamin D related compounds in biological samples using liquid chromatography?mass spectrometry: A review. Journal of Chromatography B. 878(20):1654-1661. https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2009.11.026