Protokol RNA imunoprecipitace qPCR (RIP- qPCR)

RNA imunoprecipitace (RIP)-qPCR

RNA izolované pomocí sady Magna RIP™ RNA-Binding Protein Immunoprecipitation Kit (produkt č. 17-700) lze analyzovat několika molekulárními metodami včetně end-point RT-PCR a kvantitativní RT-PCR (pokud jsou známy vazebné cíle RBP) nebo metodami microarray či hloubkového sekvenování. Vzhledem k cílovým hodnotám RNA se známou sekvencí lze navrhnout genově specifické primery, které umožňují ověřit (a kvantifikovat) RNA imunoprecipitovanou použitými protilátkami. Jakmile lze potvrdit úspěšnou RIP, lze pokračovat v dalším zkoumání populace RNA v imunoprecipitaci metodami založenými na populaci, jako je srovnávací mikroarray hybridizace výsledných cDNA nebo hloubkové sekvenování molekulárně upravených produktů reakce RIP (viz Baroni, T.E. et al., 2008. Methods Mol Biol. 419:93-108).

Níže jsou uvedeny metody pro provádění end-point nebo kvantitativního měření experimentů RIP v reálném čase s použitím kontrolní protilátky dodávané v soupravě EZ-Magna RIP™ (produkt č. 1).17-701), Anti-SNRNP70.

Pro reverzní transkripci použijte libovolné komerčně dostupné enzymy pro reverzní transkripci a systémy souprav, které pro priming používají náhodné hexamery. Protože zralá U1 snRNA ko-precipitovaná s U1 spliceozomálním proteinem SNRNP70 není polyadenylovaná, oligo d(T) priming se nedoporučuje.

Poznámka: Pro použití v této části se doporučují špičky odolné vůči aerosolu RNázy, aby se minimalizovalo riziko kontaminace.

1. Značte příslušný počet 0.2 ml zkumavek PCR pro počet vzorků, které mají být analyzovány, a umístěte je na led.
2. Přidejte 9 μl (až 2 μg RNA) příslušného vzorku do zkumavky PCR a vraťte je na led.
3. Přidejte příslušné množství činidel do každé zkumavky s reakcí PCR na led, jak je uvedeno v tabulce níže.
   

Reagencie	Objem pro 1 reakci (μl)
RNA	9.0
2X RT pufr	10.0
20X enzymová směs	1.0
Celkem na reakci	20.0

4. Umístěte zkumavky s PCR reakcí do termálního cykleru.
5. Začněte následující program RT reakce:
   

.

Reakce	37 °C	60 min
Zastavení reakce	5 min
Podržet	4 °C	Podržet

6. Vyjměte zkumavky PCR.  Reakci nařeďte 180 μl vody bez nukleázy (10x ředění). Reakce lze uchovávat při -20 °C.

Standardní RT-PCR s koncovým bodem

1. Označte příslušný počet 0,2 ml zkumavek PCR pro počet vzorků, které se mají analyzovat, a umístěte je na led.
   • Minimálně budou 4 vzorky, které budou podrobeny PCR s použitím primerů RIP obsažených v této sadě: cDNA z pozitivní a negativní kontrolní imunoprecipitace protilátek, vstup a zkumavka bez templátu jako kontrola kontaminace DNA.
   • Primery RIP jsou specifické pro lidský gen U1 snRNA. Doporučuje se, aby uživatel navrhl vhodné specifické primery pro cDNA z jiných druhů a empiricky určil podmínky reakce PCR.
2. Přidejte 2 μl příslušného vzorku do zkumavky PCR a vraťte na led.
3. Přidejte příslušné množství činidel do každé zkumavky s reakcí PCR na ledu, přičemž nejprve přidejte H2O a jako poslední Taq polymerázu.
   • Pro dosažení nejlepších výsledků použijte Hot-Start Taq polymerázu. Pokud nepoužíváte Hot-Start Taq polymerázu, Taq musí být přidán do každé zkumavky po počátečním kroku denaturace.
   • Pokud je požadována hlavní reakční směs, dávkujte dostatečné množství činidel pro jednu zkumavku navíc, abyste zohlednili ztrátu objemu.
4. Umístěte zkumavky s reakcí PCR do termálního cykléru.
5. Začněte následující program reakce PCR.
   
6. Vyjměte zkumavky s reakcí PCR. Reakce lze skladovat při -20 °C.
7. Oddělíte 10 μl každé reakce PCR pro analýzu pomocí elektroforézy ve 2% agarózovém gelu se 100 bp markerem DNA. Pro U1 snRNA obsaženou v sadě pro imunoprecipitaci proteinu vázajícího RNA EZ-Magna RIP™ (č. výrobku 17-701) je očekávaná velikost produktu PCR 100 párů bází. 

Kvantitativní PCR v reálném čase

1. Přidejte 2 μl vzorku cDNA na destičku PCR vhodnou pro vámi zvolený přístroj pro real time (doporučuje se provést trojnásobek reakcí qPCR na vzorek RIP).
2. Připravte hlavní reakční směs.  Dávkujte dostatečné množství činidel do jedné zkumavky navíc, abyste zohlednili ztrátu objemu.
3. Přidejte 23 μl směsi qPCR ke 2 μl vzorku.
4. Pomocí uzávěrů nebo optické pásky utěsněte destičku a spusťte reakce qPCR.

Další informace o návodech k experimentům RIP, tipy pro řešení problémů a doplňkové protokoly naleznete v našem Stránka RNA imunoprecipitace (RIP).