Univerzální protokol SYBR Green qPCR

Přehled technologií
Úvahy o analýze
.Metody kvantifikace
Zařízení &; spotřební materiál
Průvodce výběrem směsi pro PCR
.br> Protokol
Troubleshooting
Materiály
Reference

Přehled technologií: SYBR Green qPCR

S rozvojem termálních cyklérů s fluorescenční detekcí má PCR nové, inovativní využití. Při rutinní PCR je rozhodujícím výsledkem konečné množství amplikonu vzniklého po procesu. PCR v reálném čase nebo kvantitativní PCR a RT-PCR využívají linearitu amplifikace DNA ke stanovení absolutního nebo relativního množství známé sekvence ve vzorku. Použitím fluorescenčního reportéru v reakci je možné měřit tvorbu DNA.

Obrázek 1. Přehled technologií: SYBR Green qPCR

Při kvantitativní PCR se amplifikace DNA sleduje v každém cyklu PCR. Když je DNA v logaritmické fázi amplifikace, množství fluorescence se zvyšuje nad úroveň pozadí. Bod, ve kterém se fluorescence stává měřitelnou, se nazývá kvantifikační cyklus (C_q) nebo bod přechodu. Pomocí vícenásobného ředění známého množství standardní DNA lze vytvořit standardní křivku závislosti logaritmické koncentrace na C_q. Množství DNA nebo cDNA v neznámém vzorku pak lze vypočítat z jeho hodnoty C_q .

A) Různé fáze reakce:
Základní: Počáteční koncentrace templátu je nízká; intenzita fluorescence je proto příliš nízká na to, aby mohla být detekována, a je patrný pouze signál pozadí.
Exponenciální: Poté, co výtěžek cílové látky dosáhne prahu detekce, který je znázorněn červenou prahovou čárou, lze průběh reakce sledovat prostřednictvím exponenciální fáze.
Lineární: S rostoucí koncentrací templátu se snižuje dostupná koncentrace DNA polymerázy a rychlost reakce klesá.
Plateau: Volný enzym není dostatečný pro pokračování amplifikace, a proto se po tomto bodě reakce nachází v maximální výtěžnosti neboli ve fázi plateau.

B) Jednotlivé reakce jsou charakterizovány cyklem, při kterém fluorescence poprvé stoupne nad prahovou hodnotu, což se označuje jako kvantifikační cyklus (C_q). Pokud je výchozí materiál hojný, amplifikace je pozorována v dřívějších cyklech a C_q je nižší. Pokud je výchozího materiálu málo, amplifikace je pozorována v pozdějších cyklech a C_q je vyšší. Tato korelace mezi fluorescencí, C_q a množstvím amplifikovaného produktu umožňuje kvantifikaci templátu v širokém dynamickém rozsahu.

PCR v reálném čase se také hodí pro relativní studie. Reakci lze provést s použitím primerů jedinečných pro každou amplifikovanou oblast a označených různými fluorescenčními barvivy. Několik komerčně dostupných kvantitativních termálních cyklérů obsahuje více detekčních kanálů. V tomto multiplexním systému lze množství cílové DNA/cDNA porovnat s množstvím sledovací sekvence, např. GAPDH nebo β-aktinu.

SYBR Green qPCR Applications
Masový screening	XX
Ověřování mikročipů	Microarray Validation	XX
Více cílových genů/málo vzorků	X
X
Detekce SNP	NR
Alelická diskriminace	NR
NR
Pathogen detection	X
Multiplexování	NR
NR
Kvantifikace virové zátěže	NR
Analýza genové exprese	Analýza genové exprese	NR
X
Gene copy determination	NR
End point genotyping	NR
NR
in vitro kvantifikace	NR

NR= nedoporučuje se
X= doporučuje se
XX= preferovaná metoda

Uvažování o analýze

Příprava DNA

Nejdůležitějším krokem pro zajištění úspěchu při PCR je kvalitní příprava DNA. Zásadní je integrita a čistota templátu DNA. Kvantitativní PCR zahrnuje více kol enzymatických reakcí, a proto je citlivější na nečistoty, jako jsou proteiny, fenol/chloroform, soli, EDTA a další chemická rozpouštědla. Kontaminanty mohou také interferovat s fluorescenční detekcí. Poměr hodnot absorbance při 260 nM a 280 nM poskytuje odhad čistoty DNA. Čistá DNA má poměr A260/A280 1,8-2,0. Nižší poměry naznačují přítomnost kontaminantů, například proteinů.

Šablona

K zahájení qPCR je zapotřebí velmi málo kopií cílové nukleové kyseliny (odpovídá přibližně 100 pg gDNA nebo cDNA). Aby se minimalizovala kontaminace inhibitory reakce, mělo by být počáteční množství templátu omezeno na minimum potřebné k dosažení přesné kvantifikace. Pokud je výchozím materiálem RNA, návrh primerů a ošetření DNázou I sníží signály, které mohou být generovány kontaminací gDNA.

Návrh primerů

Ať už se používá barvivo vázající dsDNA nebo detekční chemie založená na sondě, je návrh kvalitních primerů jedním z nejdůležitějších předexperimentálních kroků při qPCR. Specifické primery pro PCR by měly být navrženy pomocí softwaru pro návrh primerů, aby se eliminovaly komplikace způsobené primer-dimery a sekundárními strukturami. Nižší koncentrace primerů snižují akumulaci tvorby primer-dimerů a tvorbu nespecifických produktů, což je rozhodující při použití barviva SYBR Green I v kvantitativní PCR.

dNTPs

Standardní mastermixy pro PCR/qPCR obsahují dATP, dCTP, dGTP a dTTP. K dispozici jsou však některé směsi, které nahrazují dTTP dUTP. Produkty z předchozích reakcí provedených s dUTP budou obsahovat uracil místo thyminu. Ty jsou pak náchylné ke štěpení pomocí uracil-DNA-glykosylázy (UNG). Předchozí inkubace následných reakcí s UNG proto zabraňuje kontaminaci přenosem mezi reakcemi. Aby byly všechny reakce v laboratoři účinné, musí používat dUTP.

Koncentrace hořčíku

Chlorid hořečnatý (MgCl₂) je nezbytný pro aktivitu reverzní transkriptázy, Taq DNA polymerázy a Taq DNA 5' až 3' exonukleázy. Optimální koncentrace Mg²⁺ pro reakce obsahující DLP se obvykle pohybují mezi 3 - 6 mM. Nižší koncentrace chloridu hořečnatého obvykle vedou k tvorbě menšího počtu nespecifických produktů. Některé roztoky ReadyMix jsou dodávány v 2násobné koncentraci 7 mM chloridu hořečnatého (konečná koncentrace 3,5 mM). V některých případech je dodávána lahvička s 25 mM roztokem chloridu hořečnatého pro případnou další optimalizaci konečné koncentrace chloridu hořečnatého. Někdy může být požadována reakční směs, která neobsahuje MgCl₂ aby bylo možné použít nízkou koncentraci, např. při použití detekce sondou Scorpion.

Reverzní transkriptáza

Pro úspěch RT-qPCR je rozhodující enzym reverzní transkriptáza, který poskytuje vysoké výtěžky cDNA a zároveň si zachovává aktivitu při vysoké teplotě. Výkon při vysokých teplotách pomáhá zajistit, aby oblasti RNA s významnou sekundární strukturou byly destabilizovány a přístupné pro hybridizaci a následnou amplifikaci. Při provádění jednostupňové RT-qPCR umožňuje vysokoteplotní výkonnost použití genově specifických primerů s vysokou teplotou tání (T_m), což zvyšuje specifičnost reakce. Při provádění dvoukrokových protokolů je důležité zajistit, aby enzym vedl k lineárnímu a proporcionálnímu výtěžku cDNA z RNA. Minimalizace pipetování může snížit variabilitu. Některé směsi ReadyMix obsahují primery a další činidla potřebná k provedení RT, například ReadyScript^® cDNA Synthesis Mix (RDRT).

Taq DNA Polymerase

Stejně jako výběr nejvhodnější reverzní transkriptázy pro RT je zásadní i výběr vhodného enzymu. Zásadním problémem přírodní Taq DNA polymerázy je, že enzym má zbytkovou aktivitu při nízké teplotě. Nespecifická vazba primerů vede v důsledku této zbytkové aktivity polymerázy k tvorbě nespecifických produktů. Tuto situaci pomáhají napravit protilátkami blokované nebo chemicky blokované Taq DNA polymerázy ("horký start"), které zabraňují aktivitě enzymu až do zahájení denaturačního kroku při vysoké teplotě. Viz Příručka pro výběr směsi PCR pro určení nejlepší polymerázy s horkým startem pro vaši aplikaci.

Interní referenční barvivo podle typu přístroje

Některé termální cyklery PCR v reálném čase vyžadují nakládací barvivo, například ROX, pro kontrolu variability optického systému a normalizaci rozdílů v intenzitě signálu. Podobně některé termální cyklery vyžadují fluorescein k vytvoření virtuálního pozadí při práci s testy s barvivem SYBR Green I (které má velmi nízké pozadí). Tyto látky mohou být dodávány ve směsi ReadyMix nebo jako samostatné složky, aby bylo možné použít vhodnou koncentraci. V některých případech je součástí balení lahvička s interním referenčním barvivem pro normalizaci reakce. Maximální excitace tohoto barviva je 586 nM a maximální emise 605 nM. Standardní nastavení přístroje pro referenční barvivo ROX je pro měření interního referenčního barviva vyhovující. Toto interní referenční barvivo je nezbytné pro systémy sekvenční detekce ABI.

Přístroje

Je třeba vybrat činidla kompatibilní s přístroji. Platformy používají různá normalizační barviva, takže bude třeba vybrat činidla s kompatibilními normalizačními barvivy (viz Příloha 1).

Mnoho přístrojů qPCR bylo navrženo tak, aby podporovaly určitý rozsah aplikací, např. kontrastujte vysokokapacitní schopnost přístroje ABI 7900 využívajícího automatické načítání 384jamkových destiček s přístrojem Illumina Eco, který podporuje jednu 48jamkovou destičku. Nejvhodnější přístroj odpovídá potřebám výzkumu. Je žádoucí vybrat přístroj s uživatelsky přívětivým softwarem, který vykonává nejžádanější funkce a má flexibilitu z hlediska výstupu dat, aby s nimi bylo možné snadno manipulovat v navazujících softwarových balících pro statistickou analýzu. Tím se zkrátí doba potřebná k zaškolení personálu, a tedy i k zahájení generování výsledků. Mezi další požadované vlastnosti patří blok PCR, který je absolutně homogenní (absolutní maximální odchylka 1C_q = 2násobek v 96 jamkách replikace), a optický systém, který excituje a detekuje emisi co nejcitlivěji a nejrovnoměrněji v širokém rozsahu vlnových délek. To umožňuje široký výběr fluoroforů a multiplexování. Dalšími vlastnostmi, které je třeba zvážit, jsou provozní náklady spojené se specifickým spotřebním materiálem, např. pokud se pro reakce nepoužívá standardní mikrotitrační destička, a také pohodlí při nakládání destiček/zkumavek, které mají nestandardní formát.

Kontroly

Vždy je užitečná pozitivní kontrola, abyste se ujistili, že všechny součásti soupravy pracují správně. Kontrola bez šablony/negativní kontrola je nezbytná pro zjištění, zda nedošlo ke kontaminaci. Signál v kontrole bez templátu prokazuje přítomnost kontaminace DNA nebo tvorbu dimerů primerů.

Pufr

Pufry nebo reakční mastermixy obvykle obsahují dNTP, Taq DNA polymerázu, MgCl₂ a stabilizátory. V závislosti na detekční chemii, přístroji a požadavcích na reakci mohou být obsaženy také SYBR Green I, ROX™, fluorescein a inertní nakládací barviva. Složky PCR pufru a stabilizátory jsou obvykle patentované výrobcem. Pokud jsou zakoupeny samostatně, je možná maximální flexibilita, protože každou složku lze v reakci individuálně optimalizovat. Naproti tomu však nákup složek společně jako mastermixu sice snižuje flexibilitu, ale zvyšuje konzistenci a pohodlí šarže a zároveň snižuje počet pipetovacích kroků, a tím i pravděpodobnost chyby a kontaminace.

Analýza dat

Postupujte podle doporučení přístroje reálného času, který se používá k provádění kvantitativní SYBR Green PCR. Novým uživatelům přístrojů mohou pomoci následující pokyny. Obecně se počet cyklů vykresluje v závislosti na fluorescenci. K určení množství templátu v každém vzorku se používají prahové cykly (C_Ts) nebo body křížení. Prahový cyklus nebo bod přechodu je první cyklus, který vykazuje detekovatelný nárůst fluorescence v důsledku tvorby produktů PCR. Cykly před bodem přechodu jsou základní cykly. Základní cykly nevykazují žádný detekovatelný nárůst fluorescence v důsledku produktů PCR. Prahovou hodnotu použitou k určení okamžiku, kdy dojde k prvnímu detekovatelnému nárůstu fluorescence, lze rovněž upravit ručně. Práh by měl být vždy stanoven na grafu logaritmické amplifikace. Na logaritmickém amplifikačním grafu by měl být práh nastaven v logaritmickém lineárním rozsahu, nikoli ve fázi plateau.

Křivky tání

Provedení analýzy křivky tání na konci běhu pomůže analyzovat pouze produkt PCR, který vás zajímá. Při analýze křivky tání postupujte podle pokynů výrobce přístroje pro měření v reálném čase. Následné běhy se stejnými primery lze upravit tak, aby se odstranil příspěvek tvorby dimeru primeru k signálu produktu, a to shromážděním dat v dalším kroku cyklování, jehož teplota musí ležet mezi již určenými teplotami tání dimeru a produktu (T_Ms).

.Metody kvantifikace

Standardní křivky

Standardní křivky jsou nezbytné pro absolutní i relativní kvantifikaci. Při vytváření standardních křivek by měly být použity různé koncentrace DNA (obvykle pět), aby se vytvořila standardní křivka, která bude odpovídat koncentraci neznámé. Každá koncentrace by měla být provedena duplicitně.

Absolutní a relativní kvantifikace

Tuto soupravu SYBR Green PCR lze použít ke kvantifikaci cílové DNA pomocí absolutní nebo relativní kvantifikace. Techniky absolutní kvantifikace se používají ke stanovení množství cílové DNA ve výchozím vzorku, zatímco relativní kvantifikace určuje poměr mezi množstvím cílové DNA a referenčního amplikonu. Ideální referenční amplikon by měl mít neměnnou, konstitutivní expresi. V praxi se pro tuto funkci volí housekeepingový gen, ale existují i jiné referenční volby, které lépe splňují výše uvedené požadavky.¹

Absolutní kvantifikace používá externí standardy pro stanovení absolutního množství cílové nukleové kyseliny, která je předmětem zájmu. Aby se odstranily rozdíly v kvantifikaci způsobené žíháním, musí být vazebná místa primerů externích standardů stejná jako místa v cílové sekvenci. Ideální externí standard obsahuje sekvence, které jsou stejné jako cílová sekvence nebo které se od cílové sekvence liší jen nepatrně. Pro absolutní kvantifikaci je nutná ekvivalentní účinnost amplifikace mezi cílovým a externím standardem. Po identifikaci vhodného konstruktu nebo amplikonu se vytvoří standardní křivka ředění externího standardu, která se použije ke stanovení koncentrací neznámých cílových vzorků.

Relativní kvantifikace umožňuje výpočet poměru mezi množstvím cílového templátu a referenčního templátu ve vzorku. Vzhledem k tomu, že tato metoda měří množství cílové látky vzhledem k pravděpodobně neměnné kontrole, používá se relativní qPCR nejčastěji k měření rozdílů v genetickém polymorfismu, například mezi tkáněmi nebo mezi zdravými a nemocnými vzorky. Výhodou této techniky je, že použití vnitřního standardu může minimalizovat odchylky při přípravě a manipulaci se vzorky. Při použití systémů SYBR musí být cílová a interní referenční kvantifikace prováděna v oddělených reakcích.

Přesnost relativní kvantifikace závisí na vhodném výběru referenční šablony pro standardy. Variabilita standardu ovlivní výsledky, a proto je nejdůležitější, aby standardy byly vhodné.¹ Někteří výzkumníci se rozhodnou neprovádět standardní křivku a vykazovat cílové množství jako podíl referenčního množství, což je technika označovaná jako komparativní kvantifikace. Případně lze předpokládat, že účinnost amplifikace cílové a referenční sekvence je zanedbatelná, a kvantifikovat cílovou sekvenci pouze na základě standardní křivky stanovené pro referenční sekvenci. A konečně, při nejpřesnější z technik relativní kvantifikace se měří amplifikační účinnost referenční i cílové sekvence a stanoví se korekční faktor. Tento proces, označovaný jako normalizace,¹ vyžaduje vzorek obsahující známé koncentrace cílového i referenčního vzorku a vytvoření dvou standardních křivek.

Stanovení účinnosti reakce PCR

Účinnost PCR mezi referenčním a cílovým vzorkem se stanoví přípravou ředicí řady pro každý cíl. Hodnoty CT referenčního vzorku se odečtou od cílového vzorku a tento rozdíl hodnot CT se vynese do grafu proti logaritmu množství templátu. Pokud je výsledný sklon přímky menší než ± 0,1, posuzuje se účinnost amplifikace jako podobná.

Zařízení

• Přístroj pro kvantitativní PCR
• Mikrocentrifuga
• Kryt s laminárním průtokem pro nastavení PCR (volitelný)

Příslušenství

• qPCR SYBR Green Mix - viz Průvodce výběrem qPCR (<.a href="#část1">část 1 a část 2)
• Šablona DNA/cDNA - reakce cDNA zředěná 1:10 pro detekci středně až vysoce exprimovaných cílů nebo 1:2 na 1:5 pro vzácné transkripty nebo 10 ng až 100 ng gDNA
• Přední a zpětné primery zředěné na pracovní koncentraci (pro většinu testů postačí pracovní zásoby 10 µM)
  • Pro většinu modelových organismů jsou k dispozici také předpřipravené primery pro genovou expresi (KiCqStart^® SYBR^® Zelené primery, KSPQ12012)
• Sterilní filtr hroty pipet
• Sterilní 1.5 ml mikrocentrifugační zkumavky se šroubovacím uzávěrem (jako například CLS430909)
• Zkumavky pro PCR, vyberte zkumavky odpovídající požadovanému formátu:
  • Individuální tenkostěnné 200 µl zkumavky pro PCR (Z374873 nebo P3114)
  li>Desky
  • Desky s 96 jamkami (Z374903).)
  • 384 jamkové destičky (Z374911)
  • Těsnění destiček
    • Těsnicí fólie ThermalSeal RTS™ (Z734438)
    • Fólie ThermalSeal RT2RR™ (Z722553)
• Voda třídy PCR (W1754)

Průvodce výběrem zelené PCR směsi SYBR - část 1

kompletní směsi ReadyMixes s horkým startem (Taq, pufr, dNTP, referenční barvivo, MgCl2)
Kompatibilní přístroje: Bio-Rad CFX384™ Bio-Rad CFX96™ Bio-Rad MiniOpticon™ BioRad MyiQ™ Bio-Rad/MJ Chromo4™ Bio-Rad/MJ Opticon 2 Bio-Rad/MJ Opticon® Cepheid SmartCycler® Eppendorf Mastercycler® ep realplex Eppendorf Mastercycler® ep realplex2 s Illumina Eco qPCR Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 3000 Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 6000.br> Qiagen/Corbett Rotor-Gene® Q Roche LightCycler™ 480	Kompatibilní přístroje: Applied Biosystems 7500 Applied Biosystems 7500 Fast Applied Biosystems ViiA 7 Stratagene Mx3000P®< /sup> Stratagene Mx3005P™ Stratagene Mx4000™	Compatible Instruments: Applied Biosystems 5700 Applied Biosystems 7000 Applied Biosystems 7300 Applied Biosystems 7700 Applied Biosystems 7900 Applied Biosystems 7900 HT Fast Applied Biosystems 7900HT Applied Biosystems StepOnePlus™ Applied Biosystems StepOne™	Kompatibilní přístroje: BioRad iCycler iQ™ BioRad iQ™5 BioRad MyiQ™	Kompatibilní přístroje: Applied Biosystems 5700 Applied Biosystems 7000 Applied Biosystems 7300 Applied Biosystems 7700 Applied Biosystems 7900 Applied Biosystems 7900 HT Fast Applied Biosystems 7900HT Applied Biosystems StepOnePlus™ Applied Biosystems StepOne™	Kompatibilní přístroje: Bio-Rad CFX384™ Bio-Rad CFX96™ Bio-Rad MiniOpticon™ BioRad MyiQ™ . Bio-Rad/MJ Chromo4™ Bio-Rad/MJ Opticon 2 Bio-Rad/MJ Opticon® Cepheid SmartCycler.sup>® Eppendorf Mastercycler® ep realplex Eppendorf Mastercycler® ep realplex2 s Illumina Eco qPCR Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 3000br> Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 6000 Qiagen/Corbett Rotor-Gene® Q Roche LightCycler™ 480
KiCqStart® SYBR® Green  qPCR ReadyMix™ (KCQS00)	KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ Low Rox (KCQS01)	KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ (zelená směs pro qPCR). s ROX (KCQS02)	KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ pro iQ (KCQS03)	SYBR® Green JumpStart™. Taq ReadyMix™ pro vysoce výkonnou qPCR (S9194)	SYBR® Green JumpStart™ Taq ReadyMix™ pro kvantitativní PCR, kapilární složeníbr> (S1816)

Průvodce výběrem zelené PCR směsi SYBR - část 2

Referenční barvivo oddělené			MgCl2 odděleně Referenční barvivo odděleně
Kompatibilní přístroje: Přístroje pro měření teploty, tlaku a vlhkosti: Viz Příloha 1 pro vyhledání optimální koncentrace referenčního barviva pro váš přístroj
SYBR® Green JumpStart™ Taq ReadyMix™ (.S4438)	LuminoCt®SYBR®Green qPCR ReadyMix™ (L6544)	SYBR® Green JumpStart™ Taq ReadyMix™ (S5193)

Protokol

Příprava

1. Všechny reakční komponenty umístěte na led.
2. Smíchejte a poté krátce odstřeďte, abyste shromáždili obsah na dně zkumavky.

Standardní reakce s barvivem SYBR Green I

Poznámka: Pozorovali jsme, že testy prováděné ve směsi KiCqStart ReadyMix jsou optimální při použití vyšší koncentrace primerů než při běžné PCR. V níže uvedených protokolech používáme konečnou koncentraci 450 nM, kterou jsme vypozorovali jako optimální koncentraci pro několik nezávislých testů.

1. V případě, že se jedná o test, který je prováděn s primerem, je třeba použít primer o koncentraci 450 nM. Připravte si dostatečné množství master mixu pro provedení všech vzorků ve dvojím provedení.
    a. Ujistěte se, že obsahuje duplikáty negativních kontrol bez šablony (NTC).
    b. Vyberte příslušnou tabulku níže podle vybraného činidla qPCR.
    c. Vypočítejte množství činidel, která je třeba smíchat. Přidejte 10 % objemu, abyste zohlednili chybu pipetování
    d. Dobře promíchejte, aby nevznikaly bubliny.

Master Mix pro reagencie KiCqStart:

Reakce	Cílová konečná koncentrace	Objem na jednu 20 μl reakci (µL)
2X qPCR směs	1X	10 μL
Přední primer (zásoba 10 µM)	0.45 µM	0.9 μL
Reverzní primer (zásoba 10 µM)	0,45 µM	0.9 μL
Voda pro PCR	-	3.2 μL

Master Mix pro ostatní kompletní qPCR ReadyMixy:

Reakce	Cílová konečná koncentrace	Objem na jednu 20 μl reakci (µL)
2X směs qPCR	1X	10 μL
Přední primer (zásoba 10 µM)	0.2 µM	0.4 μL
Reverzní primer (zásoba 10 µM)	0,2 µM	0.4 μl
Voda pro PCR	-	4,2 μl

Master Mix pro qPCR reagencie s oddělenými složkami:

Reakce	Cílová konečná koncentrace	Objem na jednu 20 μl reakci (µL)
2X qPCR směs	1X	10 μL
Přední primer (zásoba 10 µM)	0.2 µM	0,4 μL
Reverzní primer (zásoba 10 µM)	0.2 µM	0.4 μL
25mM MgCl2 (pokud je oddělený)	3,5mM	3.5 μl1
Referenční barvivo (je-li oddělené)		0 až 0.25 μl2
Voda třídyPCR		4.2 μL

¹Optimální koncentrace MgCl₂ se může pohybovat od 1mM do 6mM.
²Podívejte se na Přílohu 1 a určete optimální koncentraci referenčního barviva pro váš přístroj.

2. Nastavení reakcí:
    a. Pro reakce NTC přidejte do reakční zkumavky 4 μl vody.
    b. Pro experimentální reakce přidejte do reakční zkumavky 4 μl roztoku cDNA.
    c. Všechny zkumavky krátce odstřeďte. Vizuálně zkontrolujte, zda všechny zkumavky nebo jamky obsahují vzorek na dně ve správném objemu.
    d. Opatrně alikvotujte 16 μl templátové master směsi do každé qPCR zkumavky nebo jamky destičky.
    e. Reakce dobře promíchejte a v případě potřeby roztočte.
    f. Uzavřete zkumavky nebo uzavřete desku PCR a označte ji (podle požadavků přístroje). (Ujistěte se, že označení nezakrývá dráhu světla excitačního/detekčního přístroje.)

3. V případě, že je to nutné, použijte štítek. Spusťte vzorky podle doporučení výrobce přístroje. Níže jsou uvedeny příklady standardního a rychlého cyklování.

Standardní parametry cyklování:

	Temp	Čas
Počáteční denaturace	94 °C	2 min
40 cyklů:
Denaturace	94 °C	15 sec
Žíhání, prodloužení, a čtení fluorescence	60 °C nebo 5 °C pod nejnižší primerovou TM	1 min
(Volitelné) Podržení	4 °C pouze v případě, že výrobky budou vyčerpány na gelu

Parametry rychlé jízdy na kole:

	Temperatura (ºC)	Čas (s)
Počáteční denaturace	95	30
40 cyklů:
Krok 1	95	5
Krok 2	58	15
Krok 3	72	10

Poznámka: Použijte standardní protokol disociační křivky (sběr dat).

4. Pokyny k analýze dat naleznete v příručce k přístroji.

Příloha 1

Referenční koncentrace barviva doporučené pro použití s přístroji. Pro činidla qPCR se samostatným referenčním barvivem

Přístroj	Konečná koncentrace referenčního barviva	µl referenčního barviva (na 20 µl reakce)
Applied Biosystems 5700	1X	0.2µL
Applied Biosystems 7000	1X	0.2µL
Applied Biosystems 7300	1X	0.2µL
Applied Biosystems 7500	0.1X	0.02µL
Applied Biosystems 7500 Fast	0,1X	0.02µL
Applied Biosystems 7700	1X	0.2µL
Applied Biosystems 7900	1X	0.2µL
Applied Biosystems 7900 HT Fast	1X	0.2µL
Applied Biosystems 7900HT	1X	0.2µL
Applied Biosystems StepOnePlus™	1X	0.2µL
Applied Biosystems StepOne™	1X	0.2µL
Applied Biosystems ViiA 7	0,1X	0.2µL
Bibby Scientific Techne®Prime Pro 48	nepoužitý	-
nepoužívaný	-
Bio-Rad CFX384™	nepoužívá se	-
Bio-Rad CFX96™	nepoužívá se	-
Bio-Rad MiniOpticon™	nepoužívá se	-
Bio-Rad/MJ Chromo4™	nepoužívá se	-
Bio-Rad/MJ Opticon 2	nepoužívá se	-
Bio-Rad/MJ Opticon®	nepoužívá se	-
Cepheid SmartCycler®	nepoužívá se	-
Eppendorf Mastercycler® ep realplex	nepoužívá se	-
Eppendorf Mastercycler® ep realplex2 s	nepoužitý	-
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 3000	nepoužívá se	-
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 6000	nepoužívá se	-
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® Q	nepoužívá se	-
Roche LightCycler™ 480	nepoužívá se	-
Stratagene Mx3000P®	0.1X	0.02µL
Stratagene Mx3005P™	0,1X	0.02µL
Stratagene Mx4000™	0.1X	0,02µL

Průvodce řešením problémů

Problém	Možná příčina	Řešení
Není pozorován žádný produkt PCR.	Nějaká složka PCR chybí nebo je degradovaná.	Vždy by měla být provedena pozitivní kontrola, aby bylo zajištěno, že složky fungují. Při sestavování reakcí se také doporučuje kontrolní seznam.
	SYBR je degradován.	Provedete agarosový gel k analýze reakčního produktu. Pokud je patrný jeden pás přiměřené velikosti, je detekce chybná. SBYR Green I je citlivý na světlo a musí být chráněn.
	Teplota žíhání je příliš vysoká.	Snižujte teplotu žíhání po 2-4 °C.
	Šablona je nekvalitní.	Vyhodnoťte integritu šablony pomocí elektroforézy v agarózovém gelu. Může být nutné přečistit templát pomocí metod, které minimalizují střih a nicking. Může se stát, že v důsledku selhání extrakce nebo purifikace nebude k dispozici žádný templát.
	Primery nejsou navrženy optimálně.	Zkontrolujte sadu primerů provedením série ředění na známém templátu. Podle potřeby změňte pořadí nebo návrh.
	Počáteční teplota denaturace je příliš dlouhá.	Odstraňte aktivační krok. JumpStart Taq může být degradován při dlouhých (>3 min) počátečních denaturačních časech.
	Cílová šablona je složitá.	Ve většině případů jsou inherentně složité cíle způsobeny neobvykle vysokým obsahem GC a/nebo sekundární strukturou. Bylo zjištěno, že betain pomáhá amplifikaci templátů s vysokým obsahem GC v koncentraci 0,8-1,3 M.2
	Referenční barvivo je neshodné	Pro grafy Rn (normalizovaná fluorescence) vypněte referenční barvivo. Případně zobrazte graf surové fluorescence amplifikace qPCR. Odstraněním normalizace se často obnoví očekávaný tvar grafů, což umožní výpočet rozumnějších hodnot Ct. Případně je možné titrovat referenční barvivo v reakci. Viz návrhy v závěrečné části o řešení problémů.
	Provádí se příliš málo cyklů.	Zvýšit počet cyklů.
	Není dostatek šablony.	Poté, co zvýšení počtu cyklů nevedlo k úspěchu, zopakujte reakci s desetkrát vyšší koncentrací šablony.
	Produkt PCR je příliš dlouhý.	Nejlepších výsledků se dosáhne, když se produkty PCR pohybují mezi 100-150 bp a nepřesahují 800 bp.
	Koncentrace Mg2+ není optimální.	Optimální koncentrace chloridu hořečnatého se může lišit v závislosti na analýze a může se pohybovat v rozmezí 1,5 - 5 mM. K provedení titrace chloridu hořečnatého v tomto rozmezí použijte 25 mM MgCl2  (M8787).
	Detekce nebyla aktivována nebo byla aktivována v nesprávném kroku.	Zkontrolujte, zda je zapnut režim akvizice pro správnou detekci. Režim akvizice pro detekci SYBR Green je "single" a shromažďuje se v kroku extenze nebo volitelném kroku detekce.
	Primery jsou degradovány.	Zkontrolujte degradaci primerů na polyakrylamidovém gelu.
	Zvolena špatná vrstva barviva.	Ujistěte se, že je použitý reportér aktivován v zobrazení nastavení softwaru pro detekci sekvencí.
	Nesprávné hodnoty na ose Y	Změňte hodnoty na ose Y. V případě, že se jedná o nesprávné hodnoty na ose Y, změňte je. Dvojím kliknutím na ΔRn lze změnit hodnoty na ose y.
Účinnost PCR je příliš nízká (<80%)	Teplota žíhání je příliš nízká.	Zvyšujte teplotu žíhání v krocích po 2-3 °C.
	Šablona obsahuje inhibitory	Provedeme standardní křivku (log [DNA] vs Cq). Pokud je křivka při vysokých koncentracích DNA/cDNA nelineární, buď revidujte čištění DNA/cDNA, nebo omezte koncentrace templátu na lineární rozsah.
	Primery nejsou navrženy optimálně.	Provedete křivku tání nebo agarozový gel, abyste zkontrolovali přítomnost vícenásobných amplikonů.
	Šablona je nekvalitní.	Vyhodnoťte integritu šablony pomocí elektroforézy v agarózovém gelu. Možná bude nutné přečistit templát pomocí metod, které minimalizují střih a nicking.
	Počáteční denaturační teplota je příliš dlouhá.	Odstraňte aktivační krok. Protilátka Hot-Start Taq může být degradována při dlouhých (>3 min) počátečních denaturačních časech.
	Na sadu primerů hybridizuje více lokusů.	Provedete křivku tání nebo agarosový gel, abyste zkontrolovali přítomnost vícenásobných amplikonů. Případně pro sekvenovaný cílový genom použijte program NCBI e-PCR, který hledá vícenásobné amplikony.
	Chyby pipetování způsobují kolísání	Připravte velký objem kompletní směsi a alikvotně jej rozdělte do samostatných reakcí. Pokud kolísání přetrvává, viz níže.
	Nesprávné referenční barvivo nebo koncentrace použitá pro přístroj	Podívejte se na Dodatek 1 referenční koncentrace barviva doporučené pro použití s přístroji.
	Referenční barvivo je neshodné	Pro grafy Rn (normalizovaná fluorescence) vypněte referenční barvivo. Případně zobrazte graf surové fluorescence amplifikace qPCR. Odstraněním normalizace se často obnoví očekávaný tvar grafů, což umožní výpočet rozumnějších hodnot Ct. Pokud je normalizace požadována, je třeba určit optimální množství referenčního barviva titrací.
Signál je nezávislý na ředění templátu (více produktů nebo rozmazané produkty)	Teplota žíhání je příliš nízká.	Zvyšujte teplotu žíhání v krocích po 2-3 °C.
	Primery nejsou navrženy optimálně.	Potvrdit přesnost sekvenčních informací. Pokud jsou primery kratší než 27 nukleotidů, zkuste je prodloužit na 27-33 nukleotidů. Pokud má primer obsah GC menší než 45 %, zkuste znovu navrhnout primery s obsahem GC 45-60 %.
	Koncentrace templátu je příliš vysoká.	Snižte koncentraci templátu v reakci PCR.
	Koncentrace primerů je příliš vysoká.	Snižte koncentraci primeru v sérii dvojnásobných ředění (tj. 0,1 µM, 0,05 µM, 0,025 µM a 0,0125 µM) a podrobte tyto zkušební reakce PCR.
Účinnost PCR je příliš vysoká.	Na sadu primerů hybridizuje více lokusů.	Provedete křivku tání nebo agarozový gel, abyste zkontrolovali přítomnost vícenásobných amplikonů. Případně pro sekvenovaný cílový genom použijte program e-PCR NCBI, který hledá vícenásobné amplikony.
Technické replikace vracejí velmi rozdílné hodnoty Ct nebo údaje poskytují neprostupné amplifikační křivky	Chyby v pipetování způsobují kolísání	Připravte velký objem kompletní směsi a alikvotujte jej do samostatných reakcí. Pokud kolísání přetrvává, viz níže.
	Nesprávné referenční barvivo nebo koncentrace použitá pro přístroj	Podívejte se na Dodatek 1 referenční koncentrace barviva doporučené pro použití s přístroji.
Velká variabilita v rámci vzorků a/nebo duplikátů.	Reakce nejsou dobře promíchány.	Reakce se jemně víří a odstřeďují.
	Studny nejsou pevně uzavřeny nebo zakryty.	Pevně uzavřete nebo zakryjte všechny jamky, i ty prázdné. Volná víčka mohou narušit těsnost sousedních jamek.
	Počáteční denaturace je příliš dlouhá.	Snižte počáteční denaturaci tak, aby nepřesáhla dvě minuty.
Více produktů PCR	Primery nejsou optimálně navrženy.	Ověřte si přesnost sekvenčních informací a specifičnost sekvence primeru vůči necílové sekvenci. Zvětšete délku primerů, aby byly specifičtější pro cíl.
	Primery jsou degradovány.	Zkontrolujte degradaci primerů na polyakrylamidovém gelu.
	Koncentrace Mg2+  není optimální.	Optimální koncentrace chloridu hořečnatého se může lišit v závislosti na testu a může se pohybovat v rozmezí 1,5 - 5 mM. Pro provedení titrace chloridu hořečnatého v tomto rozmezí použijte 25 mM MgCl2 (M8787).
	Teplota žíhání je příliš nízká.	Zvyšujte teplotu žíhání v krocích po 2-3 °C.
	Kontaminace DNA	Zkontrolujte všechna činidla na možnou kontaminaci a nastavte reakce v digestoři s laminárním prouděním, abyste zabránili kontaminaci z jiných reakcí.
	Byly amplifikovány primer-dimery	Zařaďte do programu cyklování volitelný detekční krok, abyste zabránili detekci primer-dimerů.
	Koncentrace templátu je příliš vysoká.	Snižte koncentraci templátu v reakci PCR.
	Koncentrace primerů je příliš vysoká.	Snižte koncentraci primerů v sérii dvojnásobných ředění (i.tj. 0,1 µM, 0,05 µM, 0,025 µM a 0,0125 µM) a tyto zkušební reakce podrobte PCR.
Linearita hodnot bodu křížení neodpovídá logaritmu množství templátu	Příliš vysoké množství templátu.	Nepřekračujte maximální doporučené množství šablony DNA.
	Příliš nízké množství šablony.	Zvýšit množství DNA.
	Kontaminace DNA	Zkontrolujte všechna činidla, zda nejsou kontaminována, a reakce připravte v digestoři s laminárním prouděním, abyste zabránili křížové kontaminaci.
	Byly amplifikovány primer-dimery	Zařaďte do cyklovacího programu volitelný detekční krok, abyste zabránili detekci primer-dimerů.
Fluorescence nebyla detekována nebo je proměnlivá	Směs SYBR Green ReadyMix nebyla dobře promíchána.	Před použitím směs ReadyMix důkladně promíchejte, abyste zajistili, že SYBR Green bude přidána ve správné koncentraci do všech kapilár.
	Přístroj pro kvantitativní PCR je kontaminovaný.	Dekontaminujte přístroj podle pokynů výrobce.
	Křivky amplifikace dosahují maxima a poté klesají při vysokém množství templátu	Snižte počet cyklů použitých pro výpočet základní linie. Korekce základní linie je nadměrně kompenzující a neguje signál.
	Nesprávná doba expozice	Pokud používáte krytky (25) nebo optické lepicí kryty (10), změňte vhodně dobu expozice.

1. Bustin S. 2002. Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems.23-39. https://doi.org/10.1677/jme.0.0290023

2. Rees WA, Yager TD, Korte J, Von Hippel PH. 1993. Betaine can eliminate the base pair composition dependence of DNA melting. Biochemistry. 32(1):137-144. https://doi.org/10.1021/bi00052a019

3. Morrison TB, Weis JJ, Wittwer CT. 1998. Quantification of low-copy transcripts by continuous SYBR Green I monitoring during amplification. Biotechniques. 24(6):960-2.

4. Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

5. Lovatt A, McMutrie D, Black J, Doherfy J. 2002. Validation of quantitative PCR assays - Addressing virus contamination concerns. BioPharm. 15(3):22-32.

6. Dieffenbach C, Dveksler G. 1995. PCR Primer: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

7. Kellogg DE, Rybalkin I, Chen S, Mukhamedova N, Vlasik T, Siebert PD, Chenchik A. 1994. TaqStart Antibody: "hot start" PCR facilitated by a neutralizing monoclonal antibody directed against Taq DNA polymerase. Biotechniques. 16(6):1134-7.