Protokol univerzálního transfekčního činidla

Číslo výrobku:

T0956

Úvod

Naše univerzální transfekční činidlo je jedinečné složení patentované polymerní směsi. Univerzální transfekční činidlo se používá k přechodné a stabilní transfekci nukleových kyselin do různých eukaryotických buněčných linií a obtížně transfekovatelných primárních buněk. Tento rychlý a snadný protokol je kompatibilní se sérem, bezsérovým médiem a antibiotiky. 

Dodávané činidla

Univerzální transfekční činidlo se dodává jako 1 ml kapaliny v jedné lahvičce. Tento objem umožňuje buď:

• 40 transfekcí na 10 cm miskách, nebo
• 65 transfekcí na 6 cm miskách, nebo
• 110 transfekcí na 3,5 cm miskách.

Skladování

Univerzální transfekční činidlo lze skladovat při teplotě 2-8 °C po dobu až tří měsíců. Pro dlouhodobé skladování skladujte při -20 °C.  Před použitím nechte všechny součásti soupravy rozmrazit a vyrovnat na pokojovou teplotu.

Postup

Níže uvedený postup je určen pro transfekci běžných buněčných linií pomocí 1 µg/µl  DNA plazmidu (zředěného ve sterilní vodě pro molekulární biologii). Kultivujte a transfekujte buňky ve standardním médiu obsahujícím sérum nebo bez séra vhodném pro daný typ buněk.  Používejte správnou aseptickou techniku a pouze sterilní materiály.

Plasmidy DNA by měly být vysoce kvalitní, vysrážené etanolem, resuspendované ve vodě molekulárně biologické kvality na konečnou koncentraci 1 µg/µl. Optimální množství použitého univerzálního transfekčního činidla závisí na typu buněk a obecně činí 1 - 3 µl na ug plazmidové DNA.

Přítomnost séra (>5 %) a antibiotik transfekci neinhibuje a v některých případech účinnost transfekce zvyšuje. Transfekce buněk v přítomnosti séra minimalizuje toxicitu.

Tento protokol lze optimalizovat pro použití s nejrůznějšími typy buněk. Hustotu výsevu, množství použité DNA a dobu inkubace lze v případě potřeby snadno měnit, aby bylo dosaženo vyšší exprese a nižší toxicity.

Adherentní kultura

Den 1: Rozložení buněk

Buňky rozložte 18-24 hodin před transfekcí. Měla by být použita vhodná hustota výsevu, aby byla deska s buněčnou kulturou v době transfekce 90-95 % konfluentní. Ke kultivaci buněk lze použít médium obsahující sérum nebo bez séra vhodné pro daný typ buněk. 

Den 2: Transfekce

1. Pro přípravu buněk na transfekci vyměňte médium v každé kultivační jamce. Níže uvedené objemy umožní transfekci jedné jamky v šestijamkové destičce; objemy při použití jiných kultivačních misek viz tabulka 1.
2. Tyčinka A: pro přípravu DNA přidejte 1 µg plasmidové DNA do 50 µl DMEM (s vysokým obsahem glukózy, bez séra). Opatrně promíchejte.
3. Zkumavka B: pro přípravu transfekčního činidla přidejte v samostatné zkumavce 3 µl univerzálního transfekčního činidla do 50 µl DMEM (s vysokým obsahem glukózy, bez séra). Jemně promíchejte. 
4. Zkumavku B ihned přidejte do zkumavky A. (Poznámka: pořadí přidávání neobracejte). Okamžitě vortexujte a jemně odstřeďte. Nechte komplexy nerušeně tvořit při pokojové teplotě po dobu 15-20 minut.  (Poznámka: nenechte komplexační reakci pokračovat déle než 20 minut).
5. Přidejte 100 µl komplexů po kapkách do kultivační jamky (obsahující buňky a médium). Promíchejte jemným vířením.

Tabulka 1

		Trubka A		Trubka B
Kultivační misky	Objem média na jamku (ml)	Celkový objem DNA na destičku (µl)	DMEM pro ředění DNA (µl)	Celkový objem univerzálního transfekčního činidla na destičku (µl)L)	DMEM pro ředění univerzálního transfekčního činidla (µl)
96jamková destička	0.2	0,2	10	0,6	10
48jamková destička	0.5	0,5	20	1,5	20
24jamková destička	0.8	1	50	3	50
12jamková destička	1	1.5	100	4.5	100
6jamková destička	2	150	6	150
3.Talíř o průměru 5 cm	2	3	100	9	100
talíř o průměru 6 cm	3	5	250	15	250
10 cm talíř	6	8	500	24	500
Banka T-75	10	18-36	750	54-108	750

Den 2: Volitelná výměna média (citlivé buňky)

U velmi citlivých buněk lze provést kompletní výměnu média 5-24 hodin po transfekci. U většiny buněk doporučujeme měnit média pouze 48 hodin po transfekci, dokud optimalizace protokolu nevyžaduje tuto dodatečnou výměnu médií.

Den 4: Výměna média a kontrola účinnosti transfekce

1. Kompletní výměna média by měla být provedena 48 hodin po transfekci. 
2. Mezi 24-48 hodinami po transfekci lze stanovit účinnost, odebrat buňky pro další použití nebo případně zahájit stabilní selekci.
   

Stacionární kultura (suspenzní buňky)

Den 1: Rozložení buněk

Buňky rozložte 18-24 hodin před transfekcí. Měla by být použita hustota výsevu 0,5 - 1,0 x 10⁶/mL, aby byla destička s buněčnou kulturou připravena v době transfekce. Ke kultivaci buněk lze použít médium obsahující sérum nebo bez séra vhodné pro daný typ buněk.

Den 2: Transfekce

1. Pro přípravu buněk na transfekci odstraňte médium z každé kultivační jamky a nahraďte jej médiem o koncentraci 0,5 ml.5 ml čerstvého kompletního média.  Níže uvedené objemy umožní transfekci jedné jamky v šestijamkové destičce; objemy při použití jiných kultivačních misek viz tabulka 1.
2. Tyčinka A: pro přípravu DNA přidejte 2 µg plasmidové DNA do 100 µl DMEM (s vysokým obsahem glukózy, bez séra). Opatrně vířete.
3. Zkumavka B: pro přípravu transfekčního činidla přidejte v samostatné zkumavce 6 µl univerzálního transfekčního činidla do 100 µl DMEM (s vysokým obsahem glukózy, bez séra). Jemně promíchejte. 
4. Zkumavku B ihned přidejte do zkumavky A. (Poznámka: pořadí přidávání neobracejte). Okamžitě vortexujte a jemně odstřeďte. Nechte komplexy nerušeně tvořit při pokojové teplotě po dobu 15-20 minut.  (Poznámka: nenechte komplexační reakci pokračovat déle než 20 minut).
5. Přidejte 200 µl komplexů po kapkách do kultivační jamky (obsahující buňky a médium). Promíchejte jemným vířením.

Den 4: Výměna média a kontrola účinnosti transfekce

1. Kompletní výměna média by měla být provedena 48 hodin po transfekci. 
2. Mezi 24-48 hodinami po transfekci lze stanovit účinnost, odebrat buňky pro další použití nebo případně zahájit stabilní selekci.