Úvod do transfekce buněk
- Co je transfekce a jak transfekovat buňky
- Typy transfekce
- Transfekce fosforečnanem vápenatým /a>
- Liposomem zprostředkovaná transfekce
- Elektroporace
- Virální transfekce (virová transdukce)
- Výběr transfekčního činidla & transfekční protokoly
Co je transfekce a jak transfekovat buňky
Transfekce je zavedení DNA, RNA nebo proteinů do eukaryotických buněk a používá se ve výzkumu ke studiu a modulaci genové exprese. Transfekční techniky tak slouží jako analytický nástroj, který usnadňuje charakterizaci genetických funkcí, syntézy proteinů, růstu a vývoje buněk. Transfekční testy umožňují nejen pokrok v buněčném výzkumu, ale také zlepšují strategie objevování léčiv. Podobné strategie, jako je virová transfekce nebo virová transdukce, využívají lentivirové částice k vložení cizorodého materiálu do eukaryotických buněk. Zatímco bakteriální transformace je proces horizontálního přenosu genů, kdy bakterie přijímají cizí genetický materiál.
Typy transfekce
Existuje široká škála metod transfekce, které zahrnují fyzikální, chemické a biologické techniky. Tyto techniky obecně zahrnují použití metod přechodné nebo stabilní transfekce k zabudování nukleových kyselin do buněk.
Techniky přechodné transfekce zahrnují zavedení DNA do buněk, ale při této metodě se DNA neintegruje s buněčnými chromozomy. Tato technika usnadňuje vysokou účinnost transfekce a genové transkripty lze analyzovat po uplynutí 1 až 4 dnů. Pro rozsáhlou tranzientní genovou expresi (TGE) v savčích buněčných kulturách se používají transfekční nosiče, jako jsou polyethylenimin (PEI) a fosforečnan vápenatý (CaPi) lze použít. Kromě toho byly vyvinuty také rozsáhlé metody TGE s použitím buněk vaječníků čínského křečka (CHO) v nepřítomnosti séra1.
Stabilní transfekční techniky zahrnují integraci transfekované DNA do buněčných chromozomů nebo tvorbu epizomů. Stabilně transfekovanou buňku lze následně identifikovat pomocí selektovatelných markerů, jako je dihydrofolátreduktáza (DHFR), hygromycin B fosfotransferáza (HPH) a adenosin deamináza (ADA) a několik dalších.
Mezi běžně používané techniky transfekce patří srážení fosforečnanem vápenatým, lipofekce, elektroporace a virové přenosy. Kromě toho lze tyto metody použít při kotransfekci. Tyto techniky zahrnují současné dodání dvou různých nukleových kyselin do téže buňky a často se používají k dosažení stabilních transfekcí. Metody transfekcí se vyvinuly a zahrnují několik nových metod, jako jsou biolistické doručovací systémy, které k doručení nukleových kyselin do buněk používají vysokorychlostní mikročástice, a in vivo transfekční protokoly, které usnadňují systémové doručení molekul siRNA.
Transfekce fosforečnanem vápenatým
Technika transfekce fosforečnanem vápenatým zahrnuje vysrážení DNA a fosforečnanu vápenatého. Precipitace je usnadněna smícháním fyziologického roztoku pufrovaného HEPES, obsahujícího fosforečnan sodný, s roztokem chloridu vápenatého a DNA2. Glycerolový šok se často používá ke zvýšení příjmu DNA v určitých buňkách.
Ačkoli je tato technika nákladově efektivní a lze ji použít pro přechodné nebo stabilní transfekce v širokém spektru buněk, relativně malé změny pH (±0,1) mohou ovlivnit účinnost transformace. Kromě toho je pro reprodukci výsledků testu nezbytné zachovat konzistenci činidel. Tato transfekční metoda však nefunguje v RPMI nebo jiných médiích s vysokou koncentrací fosfátů.
Lipozomem zprostředkovaná transfekce
Techniky transfekce zprostředkované liposomy (lipofekce) zahrnují použití kationických lipidů tvořících liposomy nebo nelipidových polymerů. Příkladem lipofekčních transfekčních činidel může být DOTMA (N-[1-(2,3,-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylamonium chlorid)a X-tremeGENE™ transfekční činidla, která jsou vhodná pro transfekci různých DNA, malých RNA a CRISPR/Cas9 komponent do různých buněčných linií. Lipidové transfekce lze rovněž přizpůsobit pro nákladově efektivní, stejně jako vysoce výkonné systémy;tyto transfekce jsou však obvykle specifické pro daný buněčný typ.
Elektroporace Tato technika zahrnuje vystavení buněčných membrán elektrickým pulzům vysoké intenzity, které způsobí dočasnou destabilizaci v určitých oblastech buňky. Během této přechodné destabilizace se buněčná membrána stane vysoce propustnou a umožní vstup různých exogenních molekul včetně DNA4.
Elektroporace je snadná, nechemická technika, která může přinést vysokou účinnost transformace u různých typů buněk. Přestože tato technika nemění morfologii a funkce cílových buněk, může tato metoda způsobit smrt buněk, pokud transfekce není prováděna za optimálních podmínek.
.Virová transfekce (virová transdukce)
Tato metoda zahrnuje použití virových vektorů k doručení nukleových kyselin do buněk. K přenosu nukleových kyselin, a to i do obtížně transfekovatelných buněk, lze použít virové přenosové systémy, jako jsou lentiviry, adenoviry a onkoretroviry.
Ačkoli jsou virové přenosové metody vysoce účinné, mohou být poměrně pracné. Většina virů navíc vyžaduje izolaci a pečlivé sledování úrovně biologické bezpečnosti. Před prováděním virových transfekcí je také důležité zvážit několik limitujících faktorů, jako je lytická povaha virových vektorů, balení buněčných linií a specifičnost hostitelských buněk.
Výběr transfekčního činidla & Transfekční protokoly
S rozvojem transfekčních protokolů a rostoucí snadností transfekčních testů je pro dosažení optimální účinnosti transfekce nezbytné vybrat vhodné transfekční činidlo.
Při zvažování vhodného transfekčního činidla je důležité určit typ buněk a podmínky kultivace pro daný test. Vzácné buněčné kultury, neurony a primární buňky se obvykle hůře transfekují, a proto budou vyžadovat činidla, která mohou usnadnit transfekci i u obtížně transfekovatelných buněk.
Před výběrem vhodného transfekčního činidla je navíc třeba zvážit také hladiny činidla a parametry cytotoxicity. Ideální činidlo by mělo mít nízkou cytotoxicitu a vysokou účinnost transfekce pro požadované typy buněk.
Elektroporace je snadná, nechemická technika, která může přinést vysokou účinnost transformace u různých typů buněk. Přestože tato technika nemění morfologii a funkce cílových buněk, může tato metoda způsobit smrt buněk, pokud transfekce není prováděna za optimálních podmínek.
Ačkoli jsou virové přenosové metody vysoce účinné, mohou být poměrně pracné. Většina virů navíc vyžaduje izolaci a pečlivé sledování úrovně biologické bezpečnosti. Před prováděním virových transfekcí je také důležité zvážit několik limitujících faktorů, jako je lytická povaha virových vektorů, balení buněčných linií a specifičnost hostitelských buněk.
| Výrobek č. | Název | Popis | Vlastnosti &.amp; Výhody | |
|---|---|---|---|---|
| XTG360-RO | X-tremeGENE™ 360 DNA transfekční činidlo | Polymerní transfekční činidlo pro dodávání DNA, siRNA, miRNA a CRISPR/RNP do mnoha buněčných linií | - Účinné doručení siRNA/miRNA, plazmidové DNA a materiálů CRISPR/Cas9 - Exprese rekombinantních proteinů z plazmidové DNA. - Minimální změny v morfologii buněk nebo indukovaná cytotoxicita. | |
| XTG9-RO | X-tremeGENE™ 9 DNA Transfekce | - Dosáhněte nové úrovně účinnosti transfekce v primárních buňkách a nádorových buněčných liniích - Získejte fyziologicky relevantní údaje pomocí činidla s nízkými cytotoxickými účinky. - Zvyšte výkonnost experimentů a umožněte hodnocení cílů pomocí jednoduchého a konzistentního protokolu. | ||
| XTGHP-RO | X-tremeGENE™ HP DNA Transfection Reagent | - Dosáhněte nové úrovně účinnosti transfekce v primárních buňkách a nádorových buněčných liniích - Získejte fyziologicky relevantní data pomocí činidla s nízkými cytotoxickými účinky. - Zvyšte výkonnost experimentů a umožněte hodnocení cílů pomocí jednoduchého a konzistentního protokolu. | ||
| SITRAN-RO | X-tremeGENE™ siRNA Transfection Reagent | Vlastní směs lipidů a dalších složek, bez živočišných produktů. | - Snižuje expresi genů o více než 90 % u mnoha různých typů buněk. - Maximalizuje flexibilitu experimentů pomocí jediného činidla pro experimenty se snižováním exprese genů na bázi siRNA a kotransfekce. - Nízká cytotoxicita - Pracujte se sérem nebo bez něj, vyhněte se změnám média | |
| NPT01 | NeuroPorter™ Transfection Kit | Unikátní složení patentovaného kationického lipidu optimalizovaného pro doručení DNA do primárních neuronů, gliových buněk a kultivovaných neuronálních buněčných linií s vysokou účinností a nízkou toxicitou Řeší problémy, jako je nízká životaschopnost buněk, nízká účinnost transfekce a neuro-degenerace | - Optimalizováno pro primární neurony, gliové buňky a kultivované linie neuronálních buněk - Velmi nízká toxicita bez neuro-degenerace nebo stažení dendritů - Účinné dodání DNA primárním neuronům, gliovým buňkám a kultivovaným liniím neuronálních buněk - Rychlé a snadné použití - Kompatibilní s protokoly transfekce se sérem i bez něj ./td> | |
| L3287 | Transfekční činidlo Escort™ IV | Unikátní složení patentovaného polykationtového lipidu a neutrálního netransfekčního lipidu. | • Suitable for stable and transient transfection • Optimized for a wide variety of cell lines • Nízká toxicita - Kompatibilní s transfekčními protokoly se sérem i bez něj - Ideální pro hmyzí buňky | |
| L3037 | Escort™ III transfekční činidlo | Unikátní složení patentovaného polykationtového lipidu a neutrálního netransfekčního lipidu | - Vhodný pro stabilní a přechodnou transfekci - Optimalizovaný pro širokou škálu primárních buněk - Nízká toxicita.br> - Kompatibilní s transfekčními protokoly se sérem i bez něj - Ideální pro buňky PC-12 | |
| CAPHOS | Sada pro transfekci fosforečnanem vápenatým | Běžně používaná metoda pro zavedení DNA do eukaryotických buněk | - Vhodná pro přechodnou a stabilní transfekci - Reprodukovatelná pro širokou škálu typů buněk - Široce referencovaná - Levná | |
| DOTAP | DOTAP Lipozomální transfekční činidlo | Kationtová lipozomotvorná sloučenina pro transfekci DNA, RNA a dalších záporně nabitých molekul do eukaryotických buněk | - Až 100x účinnější než transfekce fosforečnanem vápenatým a DEAE - - až 100x účinnější než transfekce fosforečnanem vápenatým a DEAE. Nižší toxicita než transfekce na bázi fosforečnanu vápenatého a DEAE - Kompatibilní s transfekčními protokoly se sérem i bez něj -. Kompatibilní s protokoly transfekce in-vivo | |
| XTG360-RO | X-tremeGENE™ 360 DNA Transfection Reagent | Univerzální polymerní činidlo pro dodávání DNA, siRNA, miRNA a CRISPR/RNP do mnoha buněčných linií | - Účinné doručení siRNA/miRNA, plazmidové DNA a materiálů CRISPR/Cas9 - Exprese rekombinantních proteinů z plazmidové DNA. - Minimální změny v morfologii buněk nebo indukovaná cytotoxicita. | |
| 70967 | GeneJuice®& Transfekční činidlo | Nezaložené na lipidech chemické transfekční činidlo optimalizované pro maximální účinnost transfekce, snadné použití a minimální cytotoxicitu na široké škále savčích buněk. | - Vysoce účinný přenos DNA pro stabilní i přechodné transfekce - Minimální buněčná toxicita - Kompatibilita s médii obsahujícími i neobsahujícími sérum - Jednoduchý protokol - není třeba měnit média - Ideální pro vysoce výkonnou transfekci ve formátu desek s více jamkami /td> | |
| 72181 | 293-Free™ Transfekční činidlo | Polykační lipozomální transfekční činidlo bez živočišného původu optimalizované pro transfekci buněk HEK293 pěstovaných v suspenzní kultuře. | - Optimalizováno pro transientní transfekce suspenzních kultur HEK 293 - Pochází ze zdrojů, které nejsou živočišného původu - Minimální buněčná toxicita | |
| 72622-M | NovaCHOice® Transfekční souprava | Optimalizované transfekční činidlo speciálně vyvinuté pro produkci proteinů savců v buňkách vaječníků čínského křečka (CHO). | • Enhances expression in certain media formulations • Comprised of animal-origin free components • Compatible with many chemically defined media formulations • Eliminates the need for a culture medium change post-transfection • Vhodné pro přechodnou i stabilní transfekci | |
| 71115 | RiboJuice™ siRNA transfekční činidlo | Optimalizované, snadno použitelné siRNA transfekční činidlo formulované pro minimální toxicitu. | - Účinně dodává siRNA do široké škály savčích buněčných linií pro cílenou supresi genů - Kompatibilní s transfekčním činidlem GeneJuice® pro kotransfekci siRNA a plazmidové DNA - Používá se pro supresi genů v různých buněčných liniích | |
| 71259 | Insect GeneJuice® Transfekční činidlo | Vlastní lipozomové složení optimalizované pro maximální účinnost transfekce hmyzích buněk Sf9. | - Extrémně nízká toxicita pro buňky - Používá se pro přechodné i stabilní transfekce v médiích obsahujících sérum nebo bez séra - Používá se pro kotransfekci přenosových plazmidů s linearizovanou virovou DNA pro výrobu rekombinantních bakulovirů - Ideální pro expresi proteinů ve velkém měřítku při transfekcích suspenzních kultur | |
| TR-1003 | Polybrenová infekce / transfekční činidlo | Vysoce účinná metoda přenosu genů do savčích buněk využívající infekci retrovirovými vektory. | - Zvýšená účinnost retrovirové infekce - Používá se ke zprostředkování přenosu DNA do různých typů buněk |
Obecné protokoly
Níže jsou pro srovnání uvedeny obecné protokoly pro transfekce fosforečnanem vápenatým a techniky lipofekce. Podrobné postupy naleznete v protokolech konkrétních produktů.
Network error: Failed to fetch
Odkazy
Abyste mohli pokračovat ve čtení, přihlaste se nebo vytvořte účet.
Nemáte účet?Toto je strojově přeložená stránka.
