Úspěšná transdukce pomocí lentiviru

Metody a tipy pro úspěšné použití lentivirových produktů.

Úspěšné cílení závisí na optimalizaci klíčových citlivých kroků v procesu, včetně transdukce lentivirem. Níže uvádíme několik užitečných tipů pro manipulaci a titraci od našich odborníků na lentivirové viry z oblasti R&D. Pokud máte jakékoli dotazy týkající se vašeho projektu modifikace genomu, kontaktujte jako vždy naši technickou podporu na adrese [email protected].

• Přehled protokolu transdukce lentiviru
   

Definice klíčových pojmů:

MOI - Multiplicita infekce - poměr počtu transdukujících lentivirových částic k počtu buněk.
VP - virová částice - extracelulární infekční forma viru, která se skládá z jádra RNA nebo DNA uvnitř bílkovinného obalu
TU - transdukční jednotka - počet funkčních virových částic v roztoku, které jsou schopny transdukovat buňku a exprimovat transgen

 

Manipulace s lentiviry:

• Lentiviry jsou citlivé na extrémní změny teploty. Vícenásobné cykly zmrazování a rozmrazování a dlouhodobé vystavení okolním teplotám sníží funkční titr lentivirových částic.
  
  
• Lentivirové částice rozmrazujte na mokrém ledu. Během provádění transdukcí lentivirů je uchovávejte na ledu.
  
  
• Lentivirus by měl být po prvním rozmrazení alikvotován do menších pracovních objemů.  Všechny alikvoty, které nebyly použity v původním experimentu, okamžitě vraťte do -70 °C.  Případně si objednejte lentivirus v alikvotech pracovních objemů a rozmrazte pouze objemy, které budete potřebovat pro transdukce.
  
  
• Před vyhozením do biologického odpadu namočte veškerý virus a veškeré technické vybavení a špičky, které se dotknou viru nebo buněk obsahujících virus, na 20 minut do 10% bělidla.

Doporučení a kroky k optimalizaci nastavení vašeho experimentu

• Vytvořte křivku usmrcení pro každou buněčnou linii, kterou budete používat, abyste určili optimální koncentraci antibiotik potřebnou k výběru buněk integrovaných do lentivirových virů
  
  
• Stanovte funkční titr pro každou buněčnou linii a kombinaci lentivirových vektorů, kterou budete používat (viz níže)
  
  
• Stanovte multiplicitu infekce (MOI) pro každou buněčnou linii a kombinaci lentivirových vektorů, kterou budete používat.  MOI je poměr počtu transdukujících lentivirových částic k počtu buněk.  Důrazně se doporučuje pro každý nový typ buněk, které mají být transdukovány, otestovat rozsah MOI.
  
  
  • Plate 1,6 x 10⁴ buněk do jamek 96jamkové destičky se 120 µl čerstvého média.
  • Přidejte kontrolní virus k buňkám v rozsahu MOI. Pro většinu typů buněk je vhodný rozsah 0,1 - 10 MOI. U obtížně transfektovatelných buněčných linií může být nutné zvýšit rozsah na MOI 50 nebo 100.
  • Pokud používáte selekci antibiotiky: použijte selekční médium a identifikujte jamku s životaschopnými buňkami při nejnižší testované hodnotě MOI. Toto je MOI, které použijete v budoucích transdukčních experimentech pro tuto buněčnou linii a vektor
  • Při použití fluorescence: identifikujte jamku s požadovanou kvantifikovatelnou expresí fluoroforu při nejnižší testované hodnotě MOI.
     
• Pro výpočet množství viru potřebného po stanovení MOI:
  • (celkový počet buněk v nádobě nebo jamce) x (požadovaný MOI) = celkový potřebný TU
    
  • (celkový potřebný TU) / (TU/ml funkčního titru) = celkový ml lentivirových částic, které se přidají do každé jamky

Titrování lenvirových částic:

Po dokončení přípravy lentivirových částic je třeba před transdukcí stanovit jejich titr. Titry virů uváděné u našich lentivirových produktů se stanovují pomocí p24 ELISA. Tento test měří kapsidový protein p24 asociovaný s lenvirem.

• Titr TU/ml určujeme na základě testu p24 od společnosti ZeptoMetrix. Ke stanovení vztahu mezi pg/ml p24 a virovým titrem použijeme přepočet od Didiera Trona 
  
  
• Známé proměnné:
  1. Vliv na výsledek testu p24 má i virus, který je v krvi". V lentiviru je přibližně 2000 molekul proteinu p24 / fyzikální částice (PP).
  2. V případě, že se jedná o protein p24, je třeba počítat s jeho množstvím. 1 Da = 1 g/mol
  3. Avogadrovo číslo = 6 x 10²³ molekul/mol
  4. V případě, že se jedná o molekuly, je třeba počítat s jejich množstvím. Molekulová hmotnost proteinu p24 je 24 x 10³ Da = 24 x 10³ g/mol
  
  
• Rovnice:
  (2000 molekul/PP) ● (24 x 10³ g/mol)= 48 x 10⁶ g ● molekula / PP ● mol
  
  (48 x 10⁶ g ● molekula / PP ● mol) ÷ (Avogadrovo číslo) =
  (48 x 10⁶ g ● molekula / PP ● mol) ÷ (6 x 10²³ molekul/mol) = 8 x 10^-17 g/PP
  
  Se zaokrouhlením 8 x 10^-17 g/PP ≃ 1 x 10^-16 g/PP
  
  Převeďte g/PP na pg/PP: (1 x 10^-16 g/PP) ● (1 x 10¹² pg/g) = 1 x 10^-4 pg/PP
  
  Zjistěte inverzní hodnotu:
  Jestliže 1 x 10^-4 pg = 1 PP; inverzní hodnota je 1 pg = 1 x 10⁴ PP
  
  Proto 1 pg proteinu p24 obsahuje přibližně 10 000 PP
  
  ./li>

Účinnost balení doručovacího konstruktu, známého také jako přenosový vektor, do lentivirových částic se může značně lišit v závislosti na velikosti a složení přenosového vektoru.  Tak bude mít přiměřeně dobře zabalený lentivirový vektor s pseudotypem VSV-G infekčnost v rozmezí od 1 TU na 200 virových částic u neúčinných přenosových vektorů až po 1 TU na 1 virovou částici, pokud dojde ke 100% účinnému zabalení viru. Je důležité si uvědomit, že měření funkčního titru rekombinantního lentiviru nezávisí pouze na tom, jak účinně je přenosový vektor zabalen, ale také na účinnosti transdukce použité buněčné linie.

• K zakázkovým a hotovým lenvirovým preparátům se dodává certifikát analýzy (C of A), který udává titr p24 v transdukčních jednotkách/ml (TU/ml).
  
  
• Při výrobě prostřednictvím 96jamkového formátu (malé měřítko) byly naše lentivektory charakterizovány tak, že poskytují výtěžnost mezi 1x10⁶ a 1x10⁷ TU/mL (měřeno pomocí p24 ELISA).
  
  
• K dispozici jsou vyšší titry a objemy (ve velkém měřítku). Dostupné titry se pohybují v rozmezí 1x10⁷ a 1x10¹⁰ TU/ml (měřeno pomocí p24 ELISA) a možnosti objemů od 0,1 ml do 10 ml. Poznámka: ne všechny objemové varianty jsou dostupné v nejvyšších titrech.
  
  
• Korelace mezi p24 a funkčním titrem je specifická pro vektor a buněčnou linii. Na začátku každého transdukčního experimentu nejprve určete vztah mezi titrem p24 a funkčním titrem každého vektoru v buněčné linii, kterou budete používat. Mezi běžné metody stanovení funkčního titru patří:
  • Protokol limitního ředění k vytvoření jednotek tvořících kolonie (CFU assay)
  • Titrace pomocí fluorescenčně aktivovaného třídění buněk (FACS)
  • qRT-PCR
  • Navštivte Lenvirové protokoly pro podrobnosti
     
• Nabízíme řadu hotových kontrol a kontrol na zakázku určených k optimalizaci experimentálního nastavení a určení vztahu mezi titrem p24 a funkčním titrem. Jakmile je určena korelace mezi p24 a funkčním titrem pro každou buněčnou linii (linie) a vektor (vektory), lze stejnou korelaci použít pro zbývající experimenty se stejným vektorem a buněčnou linií.