Příprava kompetentních buněk a transformace pomocí DNA pGEX

Při těchto postupech se hostitelské buňky E. coli připraví jako kompetentní a poté se transformují buď neřezanou DNA pGEX, nebo rekombinantní DNA pGEX.

Pokud se k transformaci buněk používá elektroporace, viz Příloha 3 (Elektroporace). V opačném případě postupujte podle níže uvedeného popisu.

Transformujte 1 ng nesestříhané (supercoiled) vektorové DNA souběžně s rekombinantními ligaturami pGEX, abyste zjistili účinnost každého přípravku kompetentních buněk.

Tento protokol vychází z postupu Chung et al. (Chung, C. T. et al. Jednostupňová příprava kompetentních Escherichia coli: transformace a skladování bakteriálních buněk ve stejném roztoku. Proc. Natl. Acad. Sci. the USA 86, 2172-2175 [1989]).¹

Všechny kroky tohoto postupu by měly být prováděny asepticky.

Reagencie

Pro přípravu všech roztoků použijte dvakrát destilovanou vodu.

Zásoba glycerolu E. coli hostitelského kmene
LB médium a LB agarové plotny (připravené čerstvé):	Spojte 10 g tryptonu, 5 g kvasničného extraktu a 10 g NaCl v 900 ml vody. Promíchejte do rozpuštění a upravte objem na 1 l. Sterilizujte autoklávováním. Chcete-li připravit jako pevné médium, přidejte 1,2 % až 1,5 % agaru.
TSS (transformační a skladovací roztok) (ledově studený):	Na 100 ml: smíchejte 1. Roztok pro transformaci a skladování.0 g tryptonu, 0,5 g kvasničného extraktu, 0,5 g NaCl, 10,0 g polyethylenglykolu (Mr 3350), 5,0 ml dimethylsulfoxidu (DMSO) a 5,0 ml MgCl2 (1 M) v 70 ml sterilní destilované vody. Míchejte, dokud se nerozpustí. Upravte pH na 6,5 pomocí HCl nebo NaOH. Upravte na 100 ml sterilní destilovanou vodou. Sterilizujte přefiltrováním přes 0,2 µm filtr. Uchovávejte při teplotě 4 °C. Stabilní až 6 m.
LBG médium (LB + 20 mM glukóza):	Rozpusťte 10 g tryptonu, 5 g kvasničného extraktu a 5 g NaCl v 900 ml destilované vody. Sterilizujte autoklávováním. Po ochlazení média na 50 °C až 60 °C přidejte 10 ml sterilní 2 M glukózy. Upravte na 1 l sterilní destilovanou vodou. Chcete-li připravit jako pevné médium, přidejte 1,2 % až 1,5 % agaru.
LBGA médium a desky (LBG + 100 µg/ml ampicilinu):	Viz recept na LBG médium výše. Po autoklávování ochlaďte médium na 50 °C a poté asepticky přidejte 1 ml zásobního roztoku ampicilinu 100 mg/ml (konečná koncentrace 100 µg/ml). Chcete-li připravit médium jako pevné, přidejte 1,2 % až 1,5 % agaru.
Zásobní roztok ampicilinu:	Rozpusťte 400 mg sodné soli ampicilinu ve 4 ml vody. Sterilizujte filtrací a uchovávejte v malých alikvotech při -20 °C.
Glycerol:	80 % ve sterilní destilované vodě

Postup

1. Při použití sterilní techniky nakapejte hostitelský kmen E. coli (např. JM109, BL21 atd.) ze zásoby glycerolu na LB agarovou plotnu. Inkubujte přes noc při 37 °C.
2. Izolujte jednu kolonii a naočkujte 50 až 100 ml LB bujónu. Inkubujte při 37 °C s třepáním při 250 otáčkách za minutu. Vypěstujte buňky na hodnotu A600 0,4 až 0,5.

Kriticky důležité je, aby absorbance nebyla vyšší než 0,5. To bude trvat přibližně 3 až 6 h.

Předehřátí bujónu na 37 °C zkrátí dobu růstu.

1. Buňky se sedimentují při přibližně 2500 × g po dobu 15 min při 4 °C, poté se jemně resuspendují v 1/10 objemu (5 až 10 ml) ledově vychlazeného TSS a umístí se na led.

Buňky se musí použít k transformaci do 2 až 3 h.

Transformace kompetitivních buněk

1. Pro každou ligační reakci, stejně jako pro kontrolu nesestříhaného vektoru a negativní kontrolu (netransformované kompetentní E. coli hostitelských buněk) přidejte 1 ml čerstvě připravených kompetentních E. coli hostitelských buněk do samostatných předchlazených sterilních jednorázových odstředivek. Uchovávejte na ledu.
2. Přidejte 20 µl každé ligační reakce nebo 1 ng nesestříhaného vektoru ke kompetentním buňkám, jemně promíchejte a umístěte na 45 min na led. Do negativní kontroly nepřidávejte žádnou DNA, ale přidejte 20 µl sterilní destilované vody.
3. Inkubujte zkumavky ve vodní lázni o teplotě 42 °C po dobu 2 min, poté je krátce zchlaďte na ledu.
4. Pro každý vzorek ihned přeneste 100 µl transformovaných buněk do zkumavky obsahující 900 µl média LBG (předehřátého na 37 °C) a inkubujte 1 h při 37 °C s třepáním (250 ot./min.).
   
5. Na oddělené destičky LBGA naneste 100 µl naředěných transformovaných buněk z ligovaných vzorků a 10 µl naředěných transformovaných buněk ze vzorku bez vektoru. Na destičku také naneste 100 µl netransformovaných, kompetentních E. coli hostitelských buněk. Inkubujte destičky přes noc při 37 °C a poté pokračujte ve screeningu.
6. Pro přípravu zmrazené zásobní kultury přidejte 100 µl naředěných transformovaných buněk obsahujících DNA pGEX do 1 ml média LBGA a inkubujte 30 minut při 37 °C s třepáním při 250 otáčkách za minutu. Po inkubaci přidejte 200 µl sterilního 80% glycerolu a promíchejte pipetovací špičkou. Uchovávejte při -70 °C.

Odkazy

1. Chung CT, Niemela SL, Miller RH. 1989. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 86(7):2172-2175. https://doi.org/10.1073/pnas.86.7.2172