Protokol o transfekci DNA pomocí činidla X-tremeGENE™ 9

Příprava buněk na transfekci

Buňky přibližně  24 hodin před transfekcí ujistěte se, že jsou v optimální koncentraci (70-90 % konfluence).

Kroky před transfekcí

Počkejte X-tremeGENE™ 9 DNA Transfection Reagent, DNA a ředidlo (Opti:MEMR^® I Reduced Serum Medium nebo médium bez séra) zahřejte na +15° C až +25° C a jemně promíchejte.

• Vložte ředidlo do sterilní zkumavky.
• Přidejte X-tremeGENE™ 9 DNA Transfection Reagent do ředicího roztoku.

• Přidejte plazmidovou DNA. Pipetou jemně promíchejte.
• Inkubujte 15 min při teplotě +15° C až +25° C.

• Přidejte transfekční komplex k buňkám po kapkách.
• Mírně protřepejte nebo otáčejte jamkami nebo baňkami, abyste zajistili rovnoměrnou distribuci po celé destičce.
• Před měřením exprese proteinu inkubujte buňky po dobu 18 - 72 hodin.

Objemy X-tremeGENE™ 9 DNA Transfection Reagent a množství DNA pro různé poměry

Ratio Transfection Reagent : DNA		Minimální transfekční komplexní objem	Objem pro celou 96jamkovou destičku
	Prostředí bez sérové složky do konečného objemu /td>	100 μl	500 μl
3 : 1	X-tremeGENE™ 9 DNA Transfection eagent DNA	3 μl	3 μl	Druhová hmotnost: 1,5 g.br /> 1 μg	15 μL 5 μg
6 : 1	X-tremeGENE™ 9 DNA Transfection Reagent DNA	6 μl	30 μL 5 μg
6 : 2	X-tremeGENE™ 9 DNA Transfection Reagent DNA	6 μl	6 μl		Přípravek pro transfekci DNAbr /> 2 μg	30 μL 10 μg

Tipy pro úspěšnou transfekci

1. Skladujte X-tremeGENE™ 9 DNA Transfection Reagent při teplotě +2 až +8 °C a X-tremeGENE™ HP DNA Transfection Reagent při
   -15 až -25 °C.

2. Přibližte lahvičku obsahující X-tremeGENE™ DNA Transfection Reagent na teplotu +15 až +25 °C a před odebráním požadovaného množství ji jednu sekundu vířivě promíchejte.

3. Nezpracovávejte alikvotní části X-tremeGENE™ DNA Transfection Reagent; zbývající transfekční činidlo uchovávejte v originálních skleněných lahvičkách.

4. Minimalizujte kontakt neředěného X-tremeGENE™ DNA Transfection Reagent s plastovými povrchy.

5. Po odebrání potřebného množství ihned po použití těsně uzavřete víčko lahvičky.

6. Minimální množství X-tremeGENE™ DNA Transfection Reagent: DNA komplexu pro použití při transfekci je 100 μl. Tvorba komplexu při menším objemu výrazně snižuje účinnost transfekce.

7. Nepoužívejte zkumavky nebo mikrotitrační destičky z polystyrenu pro X-tremeGENE™ DNA Transfection Reagent: Příprava komplexu DNA. Pokud se nemůžete vyhnout polystyrenovým materiálům, ujistěte se, že transfekční činidlo pipetujete přímo do média bez séra nebo do média se sníženým obsahem séra (které neobsahuje žádné sérum).

8. Nepoužívejte silikonizované hroty pipet nebo zkumavky.

9. Ujistěte se, že buňky v době transfekce stále aktivně rostou.

10. Při provádění transfekcí zahrňte vhodné kontroly tím, že do nich zahrnete jamky s:
    (1) netransfekovanými buňkami
    (2) buňkami pouze s transfekčním činidlem
    (3) buňkami pouze s DNA

11. Optimální poměr transfekčního činidla: DNA a optimální celkové množství komplexu se může lišit v závislosti na buněčné linii, hustotě buněk, stavu růstu buněk pro test a exprimovaném genu.