Detekce, vizualizace a kvantifikace jednotlivých posttranslačních modifikací

Caleb Hopkins

Duolink^® In Situ produkty umožňují detekci, vizualizaci a kvantifikaci proteinových událostí ve vzorcích tkání a buněk připravených pro mikroskopii. Technologie in situ PLA^® na které jsou tyto produkty založeny, nabízí oproti tradičním postupům výhody, protože selektivita se zvyšuje díky dvojímu rozpoznání cílového proteinu (proteinů) sondami s protilátkami, signál může být generován pouze tehdy, když jsou sondy s protilátkami navázány v těsné blízkosti, a amplifikace DNA vede ke zvýšení citlivosti.¹

Technologie in situ PLA^® je určena k určení blízkosti dvou epitopů pomocí primárních protilátek specifických pro každý epitop.^2,3 U každého epitopu se vytvoří komplex protilátek s konjugovanými oligonukleotidy. Poté se přidá ligační činidlo, a pokud jsou oba epitopy v těsné blízkosti, konjugované oligonukleotidy hybridizují na spojovací oligonukleotid.^1,3 Vzniklá kruhová molekula DNA slouží jako templát pro reakci amplifikace valivým kruhem (RCA).^1-3 Po reakci RCA se přidají vhodně značené detekční oligonukleotidy (fluorofory pro fluorescenci a křenová peroxidáza [HRP] pro mikroskopii v jasném poli), což vede k hybridizaci 500-1 000 značených detekčních oligonukleotidů na opakující se sekvenci zakódovanou v kruhu DNA, což umožňuje pozorování jedné proteinové události.

Mezi proteinové události, které lze detekovat pomocí in situ PLA^® studií, patří posttranslační modifikace proteinů (PTM), interakce protein-protein a exprese proteinů.

Výzkum v oblasti přenosu signálů vedl k lepšímu pochopení mechanismů, které řídí buněčné procesy, jako je proliferace, migrace a apoptóza.^1,2 PTM, jako je fosforylace, ubikvitinace, acetylace a glykosylace, proteinů dráhy jsou nedílnými součástmi řízení těchto procesů.^1,2 Komplexní pochopení signální kaskády vyžaduje znalost prostorové a časové dynamiky těchto posttranslačních modifikací. Tyto informace nelze vždy získat tradičními metodami. V poslední době  in situ PLA^® experimenty odhalily PTM jak v modelech buněčných linií, tak ve tkáních fixovaných ve formalínu/parafinu, které byly při studiích prováděných jinými postupy přehlédnuty.¹

Fosforylační stav enzymů signálních drah je rozhodující pro enzymatickou aktivitu a k detekci fosforylačních událostí lze použít in situ studii PLA^®.^1,3 Pomocí samostatných primárních protilátek proti cílovému proteinu a místu fosforylace lze na rozdíl od současných diagnostických metod, které měří hladiny exprese jednotlivých proteinů, stanovit změny buněčné odpovědi. Nedávno publikovaný článek popisuje metody pro stanovení signalizace melanopsinu.³ Bylo zjištěno, že signalizace je regulována fosforylací serinových a treoninových zbytků na intracelulárních smyčkách 2 a 3 proteinkinázou A. Na základě těchto metod je možné stanovit, zda je signalizace regulována fosforylací serinových a treoninových zbytků na intracelulárních smyčkách.³ Byly použity protilátky proti karboxylovému ocasu melanopsinu a proti fosfoserinu ve spojení s oligonukleotidově konjugovanými sekundárními protilátkami (PLA^® sondy).³ Přidání fluorescenčně značených oligonukleotidových sond specifických pro amplifikovanou DNA (Duolink^® In Situ Detekční činidlo) vedlo k vytvoření zřetelné, fluorescenční skvrny pro každý pár interagujících molekul protilátek.

V jiném článku jsou popsány kvantitativní hladiny exprese izoformně specifické aktivace (fosforylace) Akt1 a Akt2 v buněčných liniích a nádorové tkáni karcinomu prsu.⁴ Množství aktivovaného Akt bylo měřeno za účelem zjištění korelace mezi aktivovanými izoformami Akt1 a Akt2 s výsledky rakoviny prsu.⁴ Zajímavé je, že předchozí imunohistochemická data se nesrovnávala s měřením fosforylované Akt1 nebo Akt2 získaným pomocí in situ metody PLA^®, což naznačuje, že<...i> in situ PLA^® experimenty s Duolink^® In Situ činidly mohou poskytnout informace, které nelze získat standardními testy.⁴

Varianty in situ PLA^® postupů umožňují detekci proteinových událostí mimo PTM. K ověření, charakterizaci a potvrzení interakcí protein-protein se tradičně používají koimunoprecipitace, Western blot, síťování a pull down testy; tyto postupy však mají svá omezení. Požadavek na blízkost in situ PLA^® reakce by byl ideální pro detekci protein-proteinových interakcí i při endogenních úrovních exprese s využitím samostatných primárních protilátek proti každému cílovému proteinu.

Budoucí snahy o in situ PLA^® studie zahrnují zaměření na přítomnost a aktivitu proteinů s nízkým výskytem, multiplexní testy pro vytváření biomarkerových profilů onemocnění a farmakologická šetření zabývající se otázkami účinnosti a bezpečnosti pro použití v klinických studiích.¹

Další dokumenty, protokoly a produkty týkající se Duolink^® naleznete na sigma.com/duolink.

Odkazy

1. Weibrecht I, Leuchowius K, Clausson C, Conze T, Jarvius M, Howell WM, Kamali-Moghaddam M, Söderberg O. 2010. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Review of Proteomics. 7(3):401-409. https://doi.org/10.1586/epr.10.10

2. Jarvius M, Paulsson J, Weibrecht I, Leuchowius K, Andersson A, Wählby C, Gullberg M, Botling J, Sjöblom T, Markova B, et al. 2007. In SituDetection of Phosphorylated Platelet-derived Growth Factor Receptor ? Using a Generalized Proximity Ligation Method. Mol Cell Proteomics. 6(9):1500-1509. https://doi.org/10.1074/mcp.m700166-mcp200

3. Blasic JR, Brown RL, Robinson PR. Phosphorylation of Mouse Melanopsin by Protein Kinase A. PLoS ONE. 7(9):e45387. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0045387

4. Spears M, Cunningham CA, Taylor KJ, Mallon EA, Thomas JSJ, Kerr GR, Jack WJ, Kunkler IH, Cameron DA, Chetty U, et al. 2012. Proximity ligation assays for isoform-specific Akt activation in breast cancer identify activated Akt1 as a driver of progression. J. Pathol.. 227(4):481-489. https://doi.org/10.1002/path.4022

Duolink a PLA jsou registrované ochranné známky společnosti Olink AB.