Příprava liposomů - Avanti^® Polární lipidy

Dr. Stephen Burgess

Chief Scientific Officer at Avanti® Polar Lipids

1. Mechanismus vzniku vezikul

Lipozomy (lipidové vezikuly) vznikají hydratací tenkých lipidových filmů nebo lipidových koláčů, kdy se hromádky kapalných krystalických dvojvrstev zkapalní a nabobtnají. Hydratované lipidové pláty se při míchání oddělují a samy se uzavírají a vytvářejí velké multilamelární vezikuly (LMV), které na okrajích brání interakci vody s uhlovodíkovým jádrem dvojvrstvy. Jakmile se tyto částice vytvoří, vyžaduje zmenšení jejich velikosti vstup energie ve formě sonické energie (sonikace) nebo mechanické energie (vytlačování).

Obrázek z Lasic, D.D., Recherche 20, 904, 1989

2. Metoda přípravy liposomů

Vlastnosti lipidových přípravků se mohou lišit v závislosti na složení (kationtové, aniontové, neutrální druhy lipidů), nicméně stejnou metodu přípravy lze použít pro všechny lipidové vezikuly bez ohledu na složení. Obecné prvky postupu zahrnují přípravu lipidů k hydrataci, hydrataci s mícháním a dimenzování na homogenní rozložení vezikul.

A. Příprava lipidů k hydrataci

Při přípravě liposomů se smíšeným složením lipidů je třeba lipidy nejprve rozpustit a smíchat v organickém rozpouštědle, aby byla zajištěna homogenní směs lipidů. Obvykle se tento proces provádí pomocí směsí chloroformu nebo chloroformu:methanolu. Záměrem je získat čirý roztok lipidů pro úplné promíchání lipidů. Obvykle se roztoky lipidů připravují v koncentraci 10-20 mg lipidů/ml organického rozpouštědla, ačkoli lze použít i vyšší koncentrace, pokud je rozpustnost lipidů a jejich promíchání přijatelné. Po důkladném promíchání lipidů v organickém rozpouštědle se rozpouštědlo odstraní, čímž vznikne lipidový film. U malých objemů organického rozpouštědla (1 ml) lze rozpouštědlo odpařit pomocí suchého proudu dusíku nebo argonu v digestoři. U větších objemů se organické rozpouštědlo odstraní rotačním odpařováním, čímž vznikne tenký lipidový film na stěnách baňky s kulatým dnem. Lipidový film se důkladně vysuší, aby se odstranilo zbytkové organické rozpouštědlo, umístěním lahvičky nebo baňky na vakuovou pumpu přes noc. Pokud je použití chloroformu nevhodné, je alternativou rozpuštění lipidů v terciárním butanolu nebo cyklohexanu. Roztok lipidů se přenese do nádob a zmrazí umístěním nádoby na blok suchého ledu nebo vířením nádoby v lázni suchého ledu a acetonu nebo alkoholu (ethanolu nebo methanolu). Při použití lázně je třeba dbát na to, aby nádoba vydržela náhlé změny teploty, aniž by praskla. Po úplném zmrazení se zmrazený lipidový koláč umístí na vakuovou pumpu a lyofilizuje se, dokud není suchý (1-3 dny v závislosti na objemu). Tloušťka lipidového koláče by neměla být větší než průměr nádoby použité k lyofilizaci. suché lipidové filmy nebo koláče lze vyjmout z vakuové pumpy, nádobu pevně uzavřít a přelepit páskou a skladovat ve zmrazeném stavu až do doby, kdy jsou připraveny k hydrataci.

B. Hydratace lipidového filmu/koláče

Hydratace suchého lipidového filmu/koláče se provádí jednoduše přidáním vodného média do nádoby se suchým lipidem a mícháním. Teplota hydratačního média by měla být vyšší než teplota krystalového přechodu gel-kapalina (Tc nebo Tm) lipidu s nejvyšším Tc před přidáním k suchému lipidu. Po přidání hydratačního média by měla být suspenze lipidů po dobu hydratace udržována nad teplotou Tc. U lipidů s vysokým přechodem se toho snadno dosáhne přenesením suspenze lipidů do baňky s kulatým dnem a umístěním baňky na rotační odpařovací systém bez vakua. Otáčení baňky s kulatým dnem v teplé vodní lázni udržované při teplotě vyšší než Tc lipidové suspenze umožňuje lipidům hydratovat v jejich tekuté fázi za přiměřeného míchání. Doba hydratace se může u různých druhů lipidů a jejich struktury mírně lišit, nicméně se doporučuje doba hydratace 1 hodina za intenzivního protřepávání, míchání nebo míchání. Rovněž se předpokládá, že ponechání suspenze vezikul přes noc v klidu (stárnutí) před zmenšením velikosti usnadňuje proces dimenzování a zlepšuje homogenitu distribuce velikosti. Stárnutí se nedoporučuje u lipidů s vysokým přechodem, protože se zvýšenou teplotou se zvyšuje hydrolýza lipidů.

Hydratační médium je obecně určeno aplikací lipidových vezikul. Mezi vhodná hydratační média patří destilovaná voda, pufrovací roztoky, fyziologický roztok a neelektrolyty, například roztoky cukrů. Pro aplikace in vivo se doporučuje fyziologická osmolalita (290 mOsm/kg). Obecně přijímané roztoky splňující tyto podmínky jsou 0,9% fyziologický roztok, 5% dextróza a 10% sacharóza. Během hydratace vytvářejí některé lipidy komplexy jedinečné pro svou strukturu. Bylo pozorováno, že vysoce nabité lipidy vytvářejí při hydrataci roztoky s nízkou iontovou silou viskózní gel. Miniatura Problém lze zmírnit přidáním soli nebo snížením velikosti suspenze lipidů. Špatně hydratující lipidy, jako je fosfatidylethanolamin, mají tendenci se při hydrataci samovolně shlukovat. Lipidové vezikuly obsahující více než 60 mol % fosfatidyletanolaminu tvoří částice s malou hydratační vrstvou obklopující vezikulu. Když se částice k sobě přibližují, neexistuje hydratační odpuzování, které by odpuzovalo přibližující se částici, a obě membrány se dostanou do energetické studny, kde se spojí a vytvoří agregáty. Agregáty se z roztoku usazují jako velké vločky, které se při míchání rozptýlí, ale po usazení se znovu vytvoří. Produktem hydratace je velká multilamelární vezikula (LMV), jejíž struktura je analogická cibuli, přičemž každá lipidová dvojvrstva je oddělena vrstvou vody. Vzdálenost mezi lipidovými vrstvami je dána složením, přičemž polyhydratující vrstvy jsou blíže k sobě než vysoce nabité vrstvy, které se oddělují na základě elektrostatického odpuzování. Po vytvoření stabilní hydratované suspenze LMV lze částice zmenšovat různými technikami, včetně sonikace nebo vytlačování.

C. Snížení velikosti lipidové suspenze

i. Sonikace

Při rozrušování suspenzí LMV pomocí sonické energie (sonikace) obvykle vznikají malé unilamelární vezikuly (SUV) o průměru v rozmezí 15-50 nm. Nejběžnějšími přístroji pro přípravu sonikovaných částic jsou sonikátory s lázní a hrotem sondy. Sonikátory s pohárkovým rohem, ačkoli jsou méně rozšířené, úspěšně produkují SUV. Sonikátory s hrotem sondy dodávají suspenzi lipidů vysokou energii, ale trpí přehřátím lipidové suspenze, což způsobuje její degradaci. Sonikační hroty mají také tendenci uvolňovat do lipidové suspenze titanové částice, které se musí před použitím odstranit odstředěním. Z těchto důvodů jsou sonikátory ve vaně nejpoužívanějším přístrojem pro přípravu SUV. Sonikace disperze LMV se provádí tak, že se zkumavka obsahující suspenzi vloží do lázňového sonikátoru (nebo se do zkumavky umístí hrot sonikátoru) a sonikuje se 5 až 10 minut nad Tc lipidu. Suspenze lipidů by měla začít čirnout a získat mírně zakalený průhledný roztok. Zákal je způsoben rozptylem světla, který je vyvolán zbytkovými velkými částicemi, které zůstávají v suspenzi. Tyto částice lze odstranit odstředěním, čímž se získá čirá suspenze SUV. Střední velikost a distribuce je ovlivněna složením a koncentrací, teplotou, dobou a výkonem sonikace, objemem a nastavením sonikátoru. Protože je téměř nemožné reprodukovat podmínky sonikace, nejsou rozdíly ve velikosti mezi šaržemi vyrobenými v různých časech neobvyklé. Také vzhledem k vysokému stupni zakřivení těchto membrán jsou SUV ze své podstaty nestabilní a při skladování pod teplotou fázového přechodu se samovolně spojují a vytvářejí větší vezikuly.

Další informace o sonikaci, přečtěte si "Morrissey Lab Protocol for Preparing Phospholipid Vesicles (SUV) by Sonication."

ii. Vytlačování

Vytlačování lipidů je technika, při níž se suspenze lipidů protlačí přes polykarbonátový filtr s definovanou velikostí pórů, aby se získaly částice o průměru blízkém velikosti pórů použitého t Thumbnail filtru. Před extruzí přes konečnou velikost pórů se suspenze LMV naruší buď několika cykly zmrazování a rozmrazování, nebo se suspenze předfiltruje přes větší velikost pórů (obvykle 0,2 µm-1,0 µm). Tato metoda pomáhá zabránit zanášení membrán a zlepšuje homogenitu rozdělení velikosti konečné suspenze. Stejně jako u všech postupů zmenšování velikosti disperzí LMV by se vytlačování mělo provádět při teplotě vyšší než Tc lipidu. Pokusy o extruzi pod Tc budou neúspěšné, protože membrána má tendenci se zanášet tuhými membránami, které nemohou projít póry. Vytlačováním přes filtry se 100nm póry se obvykle získají velké unilamelární vezikuly (LUV) o středním průměru 120-140 nm. Střední velikost částic závisí také na složení lipidů a je poměrně dobře reprodukovatelná mezi jednotlivými šaržemi.