Protokol transdukce lentivirem

Následující protokol byl vyvinut pro vysokoobsahový screening v 96jamkových destičkách.

Materiály

• MISIE^® shRNA lentivirální transdukční částice
  
• Hexadimethrin-bromid (produkt č. 1), který se používá při transdukci shRNA. H9268)
  
• MISSION pLKO.1-puro Control Transduction Particles (Product No. SHC001V)
  
• MISSION shRNA Non-Target Control Transduction Particles (Product No. SHC002V)
  
• MISSION TurboGFP Control Transduction Particles (produkt č. SHC003V)
  
• Minimální základní médium obsahující 10% fetálního telecího séra nebo růstové médium optimalizované pro konkrétní buněčnou linii
  
• 96jamkové destičky ošetřené buněčnými kulturami
  
• Mamilské buňky k transdukci

Příprava

Připravte savčí buňky tak, aby před transdukcí rostly exponenciálně a nebyly více než 70-80 % konfluentní.

Připravte si zásobní roztok hexadimetrin-bromidu v koncentraci 2 mg/ml ve vodě.

Metoda

Den 1

Přidejte 1. roztok hexadimetrin-bromidu v koncentraci 2 mg/ml ve vodě.6 x10⁴ buněk v čerstvém médiu do počtu jamek potřebného pro každý konstrukt v 96jamkové destičce. Pro každý lentivirový konstrukt a kontrolu, která má být použita, vytvořte duplikát nebo triplikát jamek.
Inkubujte 18-20 hodin při 37 °C ve zvlhčeném inkubátoru v atmosféře 5-7 % CO₂.

Poznámka: Rychlost růstu buněk se značně liší. Upravte počet nasazených buněk tak, aby při transdukci dosáhly konfluence 70 %. Při určování hustoty nánosu zohledněte také dobu, po kterou budou buňky růst před následnou analýzou.

Den 2

Odstraňte médium z jamek. Do každé jamky přidejte 110 µl média a hexadimetrin-bromid na konečnou koncentraci 8 µg/ml. Jemně talířem otáčejte, aby se promíchal.

Poznámka: Hexadimethrin-bromid zvyšuje transdukci většiny typů buněk. Některé buňky, například primární neurony, jsou na hexadimethrin-bromid citlivé. K těmto typům buněk hexadimethrin-bromid nepřidávejte. Pokud s daným typem buněk pracujete poprvé, měla by být ke zjištění citlivosti buněk použita pouze kontrolní jamka s hexadimethrinem.

Dodejte 2-15 µl lentivirových částic do příslušných jamek. Jemným otáčením destičku promíchejte. Inkubujte 18-20 hodin při 37 °C ve zvlhčeném inkubátoru v atmosféře 5-7 % CO₂. Buňky lze inkubovat pouze 4 hodiny před výměnou média obsahujícího lentivirové částice. Inkubaci přes noc se lze vyhnout, pokud existuje obava z toxicity lentivirových částic.

Poznámka: Při první transdukci lentivirového konstruktu do buněčné linie by se měl testovat rozsah objemu nebo MOI. Pro stanovení optimální účinnosti transdukce a knockdownu pro každou buněčnou linii by měly být použity 2, 5, 10 a 15 µl lentivirových částic na 1,6 x 10⁴ buněk nebo MOI 1, 2 a 5 (viz Dodatek). Účinnost transdukce lze optimalizovat pomocí kontrolních transdukčních částic MISSION TurboGFP před testováním s konstrukty shRNA.

Tabulka 1 Objem v µl pro přidání do každé jamky v 96jamkové destičce v závislosti na titru viru. Tato tabulka předpokládá ~ 70 000 buněk na jamku. Titr lentivirového viru lze nalézt na certifikátu analýzy pro každou šarži viru.

MOI	Lentivirální titr (TU/ml)
	106	107	108
0.5	35	3,5	0,35
1	N/A	7	0.7
2	N/A	14	1.4
5	N/A	35	3,5

Den 3

Odstraňte médium obsahující lentivirové částice z jamek. Do každé jamky přidejte čerstvé médium o objemu 120 µl.

Poznámka: U typů buněk, které silně nepřilnou k destičce, lze 100 µl média odstranit a nahradit 100 µl čerstvého média.

Čtvrtý den a dále

Vyměňte médium každé 3-4 dny, dokud nebudou buňky podrobeny testům.

Buňky mohou být vybrány a každý klon může být rozšířen pro testování exprese shRNA.

Lze provádět různé fenotypové, enzymatické nebo genové expresní testy. Požadovaný test by měl být optimalizován před provedením vysokoobsahového screeningu s negativními i pozitivními kontrolami.

Poznámka: Vzhledem k náhodné integraci lentiviru do genomu hostitele mohou být u různých kolonií pozorovány různé úrovně exprese TurboGFP nebo shRNA. Testování několika kolonií umožní určit optimální stupeň exprese.

Příloha

Vícečetnost infekce (MOI): Multiplicita infekce je počet transdukujících lentivirových částic na buňku. Důrazně se doporučuje, aby se pro každý nový typ buněk, které mají být transdukovány, testoval rozsah MOI. Tím se určí optimální množství lentivirového supernatantu potřebného pro účinnou transdukci každé použité buněčné linie.

Výpočet:

(Celkový počet buněk v jamce) x (Požadovaný MOI) = Celkový počet potřebných transdukčních jednotek (TU)

(Celkový počet potřebných TU) / (TU/ml uvedený na C of A) = Celkový počet ml lentivirových částic, které se přidají do každé jamky

Odkaz

1. Li M, Rossi JJ. 2007. Lentivirus Transduction of Hematopoietic Cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2007(10): https://doi.org/10.1101/pdb.prot4755