X-tremeGENE™ siRNA transfekční činidlo
Robert Slany
Department of Genetics, Friedrich-Alexander University, Erlangen, Germany.
Úvod
Malé inhibiční RNA (siRNA) se staly předmětem zájmu mnoha laboratoří. Tyto molekuly poprvé nabízejí snadný způsob, jak vyřadit expresi vybraných genů v savčích buňkách, aniž by bylo nutné využívat klasické techniky genového knockoutu.
Proces umlčování genů pomocí siRNA je evolučně velmi konzervovaný. Pravděpodobně všechna vyšší eukaryota obsahují enzymový systém (Dicer RNase), který je nutný ke zpracování dvouřetězcové RNA (dsRNA) na malé "naváděcí" molekuly. Výsledná krátká 21- až 24bp dvouvláknová RNA (siRNA) aktivuje buněčný RNázový systém (komplex RISC), který degraduje jakoukoli mRNA s komplementární sekvencí k siRNA. Průlomovým objevem pro aplikaci RNA interference (RNAi) v savčích buňkách bylo zjištění, že přímé zavedení krátkých 21-bp dsRNA oligonukleotidů do buněk zprostředkovává účinné umlčení genů, ale nevyvolává tzv. interferonovou odpověď. Tento mechanismus je v savčích buňkách přítomen jako obrana proti virům a vypíná syntézu proteinů v reakci na přítomnost jakékoli dlouhé dsRNA bez ohledu na její sekvenci1.
Praktické využití RNAi v laboratoři proto vyžaduje metodu, která umožní účinné zavedení krátkých molekul dsRNA do savčích buněk. Další překážkou, kterou je třeba překonat, je nutnost optimalizace sekvence siRNA. Ne každá 21bp dsRNA vykazuje stejnou účinnost při umlčování příslušné mRNA. Navzdory dostupnosti sofistikovaných počítačových nástrojů pro návrh siRNA je stále nutné určité množství skutečného testování. V mnoha případech existuje silná poptávka po testovacím systému, který je jednoduchý na manipulaci a umožňuje rychlé předběžné testování potenciálních RNAi oligonukleotidů z hlediska jejich účinnosti knock-down vůči proteinu zájmu. Současná transfekce siRNA a expresního plazmidu pro protein, který má být umlčen, nabízí jedinečné řešení tohoto praktického problému. Další výhodou tohoto systému je, že umlčení lze detekovat na úrovni proteinu, i když není k dispozici protilátka proti cíli. Na cDNA odpovídající cílovému genu lze navázat velké množství epitopových značek, pokud je exprimována ektopicky z vektoru. Kromě toho tento přístup umožňuje také posouzení specifičnosti siRNA, kterou je třeba kontrolovat při každém RNAi experimentu. Možné off-target efekty lze odhalit zařazením expresního vektoru pro cílový protein, který nese mutaci v rozpoznávací sekvenci siRNA.
Protože klasické metody transfekce fosforečnanem vápenatým jsou pro transfekci malých molekul dsRNA velmi neúčinné, byla testována řada nově vyvinutých lipofekčních činidel z hlediska jejich účinnosti při doručování DNA i siRNA do buněk.
Materiály a metody
Jeden den před transfekcí byla buněčná linie lidských embryonálních ledvin 293T nanesena do 4 ml DMEM (4,5 g/l glukózy, doplněného 10 % FCS a penicilinem/streptomycinem) do šestijamkových destiček v hustotě 1x106 buněk/jamku. Po inkubaci přes noc bylo médium změněno na 2 ml DMEM/FCS bez antibiotik.
Všechny použité siRNA byly chemicky syntetizovány společností Dharmacon Inc. Pro transfekci pomocí X-tremeGENE™ siRNA Transfection Reagent bylo 0,6 ug expresního vektoru (založeného na CMV promotoru) a 6,25 ul 20-uM roztoku buď specifického siRNA duplexu, nebo kontrolní siRNA namířené proti jadernému proteinu Lamin C zředěno ve 125 ul bezsérového DMEM (celkový obsah nukleové kyseliny 2,5 ug). Současně bylo do 100 ul bezsérového DMEM přidáno 25 ul X-tremeGENE™ siRNA Transfection Reagent a výsledná směs byla okamžitě spojena s naředěnými nukleovými kyselinami. Po 20 minutách inkubace při pokojové teplotě byl roztok po kapkách přidán k buňkám. Bez další výměny média byly buňky 24 hodin po lipofekci mikroskopicky posouzeny z hlediska citality a následně lyzovány pro analýzu proteinů pomocí imunoblotu podle standardních metod. Kontrolní reakce využívající běžně používaná lipofekční činidla jiných dodavatelů byly provedeny přesně podle pokynů výrobců.
Výsledky a diskuse
Až po 24 hodinách nepřetržitého kontaktu s buňkami nezpůsobilo žádné z činidel významnou mortalitu transfekované buněčné populace. Podle specifického potlačení exprese proteinů však byla schopna dopravit DNA a siRNA do buněk současně pouze činidla od dodavatele A a X-tremeGENE™ siRNA Transfection Reagent (Obrázek 1).
S činidlem od dodavatele B byla zjištěna exprese proteinů, ale RNAi efekt zcela chyběl, což naznačuje, že RNA není touto sloučeninou účinně transfekována. Lipofekční složka od dodavatele C byla se směsí DNA/RNA zcela neúčinná. Naproti tomu po lipofekci činidlem od dodavatele A a X-tremeGENE™ siRNA Transfection Reagent byla pozorována jasná inhibice exprese cílového genu specifickou siRNA. Při přímém srovnání dvou lipozomových přípravků se zdá, že X-tremeGENE™ siRNA Transfection Reagent je lepší. Po transfekci přípravkem X-tremeGENE™ siRNA Transfection Reagent se exprimuje více proteinu, což ukazuje vysokou účinnost transfekce, které lze s touto látkou dosáhnout. Vzhledem k tomu, že lepší rychlost transfekce umožňuje detekci proteinů s menším počtem buněk, lze tento typ testu provádět s X-tremeGENE™ siRNA Transfection Reagent v mnohem menších objemech jamek, což umožňuje provádět tyto experimenty ve formátu s vyšší výkonností.
Podle poměru potlačení dosaženého specifickou siRNA oproti kontrolní siRNA lze soudit, že vyšší transfekční účinnost činidla X-tremeGENE™ siRNA Transfection Reagent ve srovnání s činidlem od dodavatele A není omezena pouze na transport RNA nebo DNA. To je důležité, protože přednostní transfekce pouze jednoho typu nukleové kyseliny by mohla pozorovaný účinek RNAi značně zkreslit a vést tak k nesprávnému posouzení základní inhibiční účinnosti. Souhrnně řečeno, X-tremeGENE™ siRNA Transfection Reagent je vynikající nové činidlo pro jakýkoli požadavek transfekce ve spojení se siRNA.
Obrázek 1:Typický příklad imunoblotu. Buňky byly ko-transfekovány 0,6 ug expresního vektoru pro protein značený FLAG a 6,25 µl 20 µM roztoku buď specifické siRNA, nebo kontrolní siRNA namířené proti IamC, jak je uvedeno. Šipka označuje očekávanou polohu proteinu značeného FLAG. Byla použita stejná množství buněčných proteinů (20 µg/l). Reagencie byly použity, jak je uvedeno.
Network error: Failed to fetch
Odkazy
Pouze pro použití v přírodovědném výzkumu.
Není určeno pro diagnostické postupy.
Abyste mohli pokračovat ve čtení, přihlaste se nebo vytvořte účet.
Nemáte účet?Toto je strojově přeložená stránka.
