TRI Reagens^® Protokoll

Mit csinál a TRI Reagens^® mit csinál?

A TRI Reagent^® oldat (TRIzol néven is árulják) egy keverék, amely a guanidin tiocianát és fenol egy monofázisú oldatban, amelyet DNS, RNS és fehérje izolálására használnak emberi, állati, növényi, élesztő, baktérium és vírus biológiai mintákból. Gátolja az RNáz aktivitást. TRI Reagens^® a biológiai minta homogenizálására szolgál, amelyből RNS-t, DNS-t vagy fehérjéket vonnak ki.

Eljárások

Minta előkészítése

1A. Szövet:
Homogenizáljuk a szövetmintákat TRI Reagensben (1 ml per 50-100 mg szövet) egy Polytron^® vagy más megfelelő homogenizátorban.

Megjegyzés: Ha a DNS minimális nyírására van szükség, ne Polytron, hanem laza homogenizálót használjunk (lásd DNS-izolálás, 3. lépés, b) megjegyzés). A szövet térfogata nem haladhatja meg a TRI Reagens térfogatának 10%-át.

1B. Monolayer sejtek:
Lízingeljük a sejteket közvetlenül a tenyészcsészén. Használjon 1 ml TRI Reagens-t 10 cm² üvegtenyésztő tányér felületénként. A reagens hozzáadása után a sejtlizátumot többször át kell vezetni egy pipettán, hogy homogén lizátumot kapjon.

Figyelem: A TRI Reagens nem kompatibilis a műanyag tenyésztőlemezekkel.

1C. Szuszpenziós sejtek:
A sejteket centrifugálással izoláljuk, majd ismételt pipettázással lúzzuk a TRI Reagensben. Egy ml reagens elegendő 5-10 × 10⁶ állati, növényi vagy élesztő sejtek, vagy 10⁷ baktériumsejtek líziséhez.

Megjegyzés:

• Ha a minták magas zsír-, fehérje-, poliszacharid- vagy extracelluláris anyagtartalmúak, például izom, zsírszövet és növényi gumós részek, további lépésre lehet szükség. A homogenizálás után a homogenátumot 12 000 × g -en 10 percig 2-8 °C-on centrifugáljuk, hogy eltávolítsuk az oldhatatlan anyagot (extracelluláris membránok, poliszacharidok és nagy molekulatömegű DNS). A felülúszó RNS-t és fehérjét tartalmaz. Ha a minta magas zsírtartalmú volt, a vizes fázis felszínén egy zsírréteg lesz, amelyet el kell távolítani. A tiszta felülúszót tegye át egy új csőbe, és folytassa a 2. lépéssel. A nagy molekulatömegű DNS-t nyerje ki a pelletből a DNS-izolálás, 2. és 3. lépés szerint.
• Egyes élesztő- és baktériumsejtekhez homogenizátorra lehet szükség.
• A sejtek homogenizálása vagy TRI Reagensben történő lizálása után a minták -70 °C-on akár 1 hónapig is tárolhatók.

Fázisszétválasztás: A nukleoprotein komplexek teljes disszociációjának biztosítása érdekében hagyja a mintákat 5 percig szobahőmérsékleten állni. Adjunk 0,1 ml 1-brom-3-klórpropanot vagy 0,2 ml kloroformot (lásd Fázisszétválasztás, a és b megjegyzés) a felhasznált TRI reagens ml-enként. Fedjük le szorosan a mintát, rázzuk erőteljesen 15 másodpercig, és hagyjuk állni 2-15 percig szobahőmérsékleten. Centrifugáljuk az így kapott keveréket 12 000 × g -en 15 percig 2-8 °C-on. A centrifugálás az elegyet 3 fázisra választja szét: egy piros szerves fázisra (amely fehérjét tartalmaz), egy interfázisra (amely DNS-t tartalmaz) és egy színtelen felső vizes fázisra (amely RNS-t tartalmaz).

Megjegyzés:

• Az 1-brom-3-klór-propan kevésbé mérgező, mint a kloroform, és a fázisszétválasztáshoz való használata csökkenti az RNS DNS-szel való szennyeződésének lehetőségét.⁴
• A fázisszétválasztáshoz használt kloroform nem tartalmazhat izoamilalkoholt vagy más adalékanyagokat.
• A poli A⁺ frakció izolálásához a vizes fázisból lásd I. függelék.

RNS izolálás vagy extrakció

1. Vigyük át a vizes fázist egy friss csőbe, és adjunk hozzá 0.5 ml 2-propanol -t a mintaelőkészítés, 1. lépés során használt TRI reagens milliliterenként, és keverje össze. Hagyja állni a mintát 5-10 percig szobahőmérsékleten. Centrifugáljuk 12 000 × g -en 10 percig 2-8 °C-on. Az RNS-csapadék pelletet képez a cső oldalán és alján.

Megjegyzés: Az interfázist és a szerves fázist 2-8 °C-on tárolja a DNS és a fehérjék későbbi izolálásához.

2. Távolítsuk el a felülúszót, és mossuk ki az RNS-pelletet úgy, hogy az 1 mintaelőkészítés lépésben használt 1 ml TRI reagenshez legalább 1 ml 75%-os etanolt adunk. Vortexeljük a mintát, majd 7 500× × g centrifugáljuk 5 percig 2-8 °C-on.

Megjegyzés:

• Ha az RNS-pelletek lebegnek, végezze el a mosást 75 %-os etanol 12 000 × g mellett.
• A minták etanolban 2-8 °C-on legalább 1 hétig, -20 °C-on pedig akár 1 évig is tárolhatók.

3. Röviden szárítsa az RNS-pelletet 5-10 percig levegőn szárítva vagy vákuum alatt. Ne hagyja az RNS-pelletet teljesen kiszáradni, mivel ez nagymértékben csökkenti az oldhatóságát. Ne szárítsa az RNS-pelletet centrifugálással, vákuum alatt (Speed-Vac®). Adjunk megfelelő mennyiségű formamidot, vizet vagy 0,5%-os SDS-oldatot az RNS-pellethez. Az oldódás megkönnyítése érdekében keverje össze ismételt pipettázással mikropipettával 55-60 °C-on 10-15 percig.

Megjegyzés:

• A végleges RNS-készítmény DNS- és fehérjementes. Az A260 - A280 aránynak ≥1,7-nek kell lennie.
• Típusos hozamok szövetekből (mg RNS/mg szövet): máj, lép, 6-10 mg; vese, 3-4 mg; vázizom, agy, 1-1.5 mg; méhlepény, 1-4 mg.
• Típusos hozamok tenyésztett sejtekből (mg RNS/106 sejt):  hámsejtek, 8-15 mg; fibroblasztok, 5-7 mg.
• Az RNS etídium-bromid festése agaróz gélekben két domináns sávot tesz láthatóvá: kis (2 kb) és nagy (5 kb) riboszomális RNS, alacsony molekulatömegű (0.1-0,3 kb) RNS-t, valamint a nagy molekulatömegű (7-15 kb) RNS diszkrét sávjait.

DNS-izolálás vagy -extrakció

1. Óvatosan távolítsa el az interfázist fedő maradék vizes fázist, és dobja el. A DNS kicsapásához az interfázisból és a szerves fázisból adjunk 0,3 ml 100%-os etanolt a mintaelőkészítés 1. lépésében használt 1 ml TRI-reagenshez. Inverzióval keverjük össze, és hagyjuk állni 2-3 percig szobahőmérsékleten. Centrifugáljuk 2 000 × g-nél 5 percig 2-8 °C-on.

Megjegyzés: A fennmaradó vizes fázis eltávolítása a DNS kicsapása előtt kritikus lépés az izolált DNS minősége szempontjából.

2. Vegye ki a felülúszót, és tárolja 2-8 °C-on a fehérjeizoláláshoz. A DNS-pelletet mossuk ki kétszer 0,1 M trinátrium-citrát, 10%-os etanol oldatban. Használjunk 1 ml mosóoldatot minden 1 ml TRI-reagenshez, amelyet a mintaelőkészítés 1. lépésében használtunk. Minden mosás során hagyjuk a DNS-pelletet legalább 30 percig állni (időnkénti keverés mellett). Centrifugáljuk 2 000 × g-nél 5 percig 2-8 °C-on. Reszuszpendáljuk a DNS-pelletet 75%-os etanolban (1,5-2 ml minden ml TRI-reagenshez), és hagyjuk állni 10-20 percig szobahőmérsékleten.

Megjegyzés:

• Fontos: Ne csökkentse a minták mosóoldatban való tartózkodásának idejét. Harminc perc az abszolút minimális idő a fenol hatékony eltávolításához a DNS-ből.
• Ha a pellet >200 mg DNS-t vagy nagy mennyiségű nem DNS anyagot tartalmaz, további mosásra van szükség 0,1 M trinátrium-citrát, 10%-os etanol oldatban.
• A 75%-os etanolban szuszpendált minták 2-8 °C-on több hónapig tárolhatók.

3. Szárítsa a DNS-pelletet 5-10 percig vákuum alatt, és oldja fel 8 mM NaOH-ban ismételt lassú pipettázással mikropipettával. Adjunk elegendő 8 mM NaOH-t a 0,2-0,3 mg/ml DNS végkoncentrációhoz (jellemzően 0,3-0,6 ml-t az 50-70 mg szövetből vagy 107 sejtből izolált DNS-hez). Ez az enyhe lúgos oldat biztosítja a DNS-pellet teljes feloldását. Centrifugáljuk 12 000 × g centrifugálással 10 percig az oldhatatlan anyag eltávolítása érdekében, és a felülúszót helyezzük át egy új csőbe.

Megjegyzés:

• A viszkózus felülúszó a nagy molekulatömegű DNS jelenlétét jelzi.
• A DNS mérete a homogenizálás során kifejtett erőtől függ. Kerülje a Polytron homogenizátor használatát.
• A 8 mM NaOH-ban feloldott minták 2-8 °C-on tárolhatók egy éjszakán át. Hosszú távú tároláshoz állítsa be a pH-értéket 7 és 8 közé, és egészítse ki EDTA-val (végső koncentráció 1 mM).
• A DNS-koncentráció meghatározásához vegyen ki egy aliquotát, hígítsa vízzel, és mérje meg az A260 értéket.Kétszálú DNS esetén 1 A260 egység/ml = 50 µg/ml.
• A sejtek számának kiszámításához feltételezzük, hogy az emberi, patkány és egér 106 diploid sejtjének DNS-mennyisége egyenlő 7 db.1 µg, 6,5 µg, illetve 5,8 µg.
• Típusos szöveti hozamok (µg DNS/mg szövet): máj, vese, 3-4 µg; vázizom, agy és placenta, 2-3 µg.
• Típusos hozamok tenyésztett emberi, patkány- és egérsejtekből: 5-7 µg DNS/106 sejt.

A DNS PCR-rel történő amplifikálásához

A 8 mM NaOH-ban való feloldás után állítsuk be a pH 8-ra.4 segítségével HEPES  (adjunk hozzá 86 µl 0,1 M HEPES, szabad sav/ml DNS-oldatot). Adjunk mintát (általában 0,1-1 µg) a PCR-keverékhez, és kövessük PCR protokoll.

A DNS restrikciós enzimekkel történő emésztéséhez

A DNS-oldat pH-ját állítsa be a restrikciós enzimekkel történő emésztéshez szükséges pH-ra a HEPES, vagy dializáljuk a mintákat 1 mM EDTA-val, pH 7-8. Hagyja, hogy a restrikciós enzimes emésztés optimális körülmények között 3-24 órán keresztül folytatódjon. Javasoljuk, hogy 1 µg DNS-re 3-5 egységnyi enzimet használjunk. Általában a DNS 80-90%-a emésztődik meg.

Proteinizolálás

1. A fehérjéket (lásd a megjegyzést) a fenol-etanol felülúszóból kicsapjuk (DNS izolálás, lépés 2) 1. A fehérjéket (lásd a megjegyzést) 1.5 ml 2-propanol per 1 ml TRI-reagens, amelyet a mintaelőkészítés, 1. lépés során használtunk. Hagyjuk a mintákat legalább 10 percig állni szobahőmérsékleten. Centrifugáljuk 12 000 × g -en 10 percig 2-8 °C-on.

Megjegyzés: Egyes minták esetében a fehérjepellet nehezen oldódik fel 1%-os SDS-ben (3. lépés). Használja ezt az alternatív eljárást a probléma orvoslására:

• Dializálja a fenol-etanol felülúszót 3 0 váltás ellenében.1%-os SDS-t 2-8 °C-on.
• Centrifugáljuk a dializátumot 10 000 × g -on 10 percig 2-8 °C-on.
• A tiszta felülúszó fehérjét tartalmaz, amely alkalmas a Western blotting eljárásokban való felhasználásra.

2. Dobja el a felülúszót, és mossa a pelletet 3 -szor 0.3 M guanidin-hidrokloridból 95%-os etanolos oldatban, 2 ml-t használva 1 ml TRI-reagensre, amelyet a minta előkészítése, 1. lépés során a mintákat 20 percig szobahőmérsékleten a mosóoldatban tároljuk. Centrifugáljuk 7 500 × g -on 5 percig 2-8 °C-on. A 3 mosás után adjunk hozzá 2 ml 100%-os etanolt, és vortexeljük a fehérjepelletet. Hagyjuk állni 20 percig szobahőmérsékleten. Centrifugáljuk 7 500 × g -on 5 percig 2-8 °C-on.

Megjegyzés: A fehérjemintákat 0.3 M guanidin-hidroklorid 95%-os etanol oldatban vagy 100%-os etanolban 1 hónapig tárolható 2-8 °C-on vagy 1 évig -20 °C-on.

3. Szárítsuk a fehérjepelletet vákuum alatt 5-10 percig. Oldjuk fel a pelletet 1% SDS-ben úgy, hogy a mikropipetta dugattyúját a hegyével az oldatban dolgoztatjuk. Távolítsuk el az oldhatatlan anyagot 10 000 × g 10 percig tartó centrifugálással 2-8 °C-on. A felülúszót tegyük át egy új csőbe. A fehérjeoldatot azonnal fel kell használni Western blottinghoz vagy -20 °C-on kell tárolni.

Hibaelhárítási útmutató

1. RNS izolálása:

A. Az alacsony hozam oka lehet:

• a minták nem teljes homogenizálása vagy lízise.
• a végső RNS-pellet esetleg nem oldódott fel teljesen.

B. Ha az A260 az A280 arány <1,65:

• a homogenizáláshoz használt minta mennyisége túl kicsi lehetett.
• a mintákat a homogenizálás után nem hagyták 5 percig szobahőmérsékleten állni.
• előfordulhatott, hogy a vizes fázis szennyeződött a fenolos fázissal.
• előfordulhatott, hogy a végső RNS-pellet nem oldódott fel teljesen.

C. Ha az RNS lebomlása következik be:

• előfordulhat, hogy a szöveteket az állatból való eltávolítás után nem dolgozták fel azonnal vagy nem fagyasztották le.
• előfordulhat, hogy az izoláláshoz használt mintákat vagy az izolált RNS-készítményeket -20 °C-on tárolták az eljárásban előírt -70 °C helyett.
• előfordulhat, hogy a sejteket tripszin emésztéssel diszpergálták.
• az eljáráshoz használt vizes oldatok vagy csövek nem voltak RNS-mentesek.
• az agaróz gélelektroforézishez használt formaldehid pH-értéke <3,5,

D. Ha DNS-szennyeződés van:

• a minta homogenizálásához használt reagens mennyisége túl kicsi lehetett.
• az izoláláshoz használt minták szerves oldószereket (etanol, DMSO), erős puffereket vagy lúgos oldatot tartalmazhattak.

2. DNS izolálás:

A. Az alacsony hozam oka lehet:

• a minták nem teljes homogenizálása vagy lízise.
• a végleges DNS-pellet esetleg nem oldódott fel teljesen.

B. Ha az A260 az A280 arány <1,70:

• előfordulhat, hogy a DNS-preparátumból nem távolították el kellőképpen a fenolt. Próbálja meg még egyszer átmosni a DNS-pelletet 0,1 M trinátrium-citrát, 10%-os etanol oldattal.

C.  Ha a DNS degradálódik:

• a szöveteket az állatból való eltávolítás után esetleg nem dolgozták fel vagy fagyasztották le azonnal.
• az izoláláshoz használt mintákat esetleg -20 °C-on tárolták az eljárásban meghatározott -70 °C helyett.
• lehet, hogy a mintákat Polytron vagy más nagy sebességű homogenizátorral homogenizálták.

D.   Ha RNS-szennyeződés van:

• lehet, hogy túl sok vizes fázis maradt a szerves fázis és az interfázis között.
• lehet, hogy a DNS-pelletet nem mostuk eléggé 0,1 M trinátrium-citrát, 10%-os etanol oldattal.

3. Fehérjeizolálás:

A. Az alacsony hozam oka lehet:

• a minták nem teljes homogenizálása vagy lízise.
• a végső fehérjepellet esetleg nem oldódott fel teljesen.

B. Ha a fehérje lebomlik:

• előfordulhat, hogy a szöveteket az állatból való eltávolítás után nem dolgozták fel vagy fagyasztották le azonnal.

C. Ha PAGE sávdeformációt mutat:

• a fehérjepelletet esetleg nem mosták ki kellőképpen.

Függelék

I. Poli A+ RNS izolálása
Miután az RNS-t 2-propanollal kicsapattuk (RNS izolálás, 1. lépés), oldjuk fel a pelletet poli -ban.nbsp;A+ -kötő pufferben, és az mRNS szelektív eltávolítása érdekében Aviv és Leder eljárása szerint oligo-dT cellulózosz oszlopon kell átvezetni.³

II. Az izolált RNS-t a RT-PCR

1. Az eljárás módosítása azáltal, hogy a kezdeti mintaelőkészítés, 1B lépés c. megjegyzésében további centrifugálási lépést hajtunk végre, tovább minimalizálja a DNS-szennyeződés lehetőségét a TRI Reagent LS segítségével extrahált RNS-ben.

2. Az RNS-minták RT-PCR-ben való felhasználása esetén az etanol teljesebb elpárologtatása szükséges. Ez különösen kritikus a kis térfogatú minták (5-20 μL) esetében, amelyek viszonylag nagy mennyiségű etanolt tartalmazhatnak, ha nem szárítják meg őket megfelelően.

Hivatkozások

1. Chomczynski P. 1993. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques. 15(3):536-7.

2. Chomczynski P, Sacchi N. 1987. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162(1):156-159. https://doi.org/10.1016/0003-2697(87)90021-2

3. Aviv H, Leder P. 1972. Purification of Biologically Active Globin Messenger RNA by Chromatography on Oligothymidylic acid-Cellulose. Proceedings of the National Academy of Sciences. 69(6):1408-1412. https://doi.org/10.1073/pnas.69.6.1408

4. Chomczynski P, Mackey K. 1995. Substitution of Chloroform by Bromochloropropane in the Single-Step Method of RNA Isolation. Analytical Biochemistry. 225(1):163-164. https://doi.org/10.1006/abio.1995.1126