Lízis és fehérje extrakció

A sejtek bontására és tartalmuk elemzésre való előkészítésére számos módszer áll rendelkezésre. Általában kíméletes módszereket alkalmaznak, ha a minta könnyen lizálható tenyésztett sejtekből vagy vérsejtekből áll, míg a robusztusabb baktérium- vagy növényi sejtek, illetve kötőszövetbe ágyazott emlőssejtek bontására erőteljesebb módszereket alkalmaznak.

• Detergens alapú lízis: Detergens alapú lízis: A detergens alapú lízis egy kíméletes módszer, amely emlőssejtek, baktériumsejtek, élesztőgombák és növények esetében alkalmazható. A sejtszuszpenziókat kíméletesen centrifugáljuk, majd újra szuszpendáljuk a sejtmembránt megbontó detergenseket tartalmazó lízisoldatban. A membránok szolubilizálódnak, a sejtek lízisbe kerülnek és felszabadul a tartalmuk. A detergenseket esetleg el kell távolítani a downstreamben, ha zavarják az elemzést vagy a termelést.
• Fagyasztás-felengedés lízis: Ez a módszer emlős- vagy baktériumsejtek szuszpenzióira alkalmazható. A sejtszuszpenziót folyékony nitrogén segítségével gyorsan lefagyasztják. Ezután a mintát felolvasztjuk, és lízispufferben pipettázással vagy enyhe vortexeléssel reszuszpendáljuk, a folyamatot többször megismételve. A ciklusok között a mintát centrifugáljuk, és az oldható fehérjét tartalmazó felülúszót visszatartjuk.
• Oszmotikus sokk: Ez egy nagyon kíméletes módszer, amely elegendő lehet a szuszpendált emlős- vagy baktériumsejtek líziséhez detergens használata nélkül. A gyakran mechanikus bontással kombinált módszer a magas ozmotikus közegről alacsony ozmotikus közegre való váltásra épül, és jól alkalmazható olyan alkalmazásokban, ahol a lizátumot később szubcelluláris komponensekre kell frakcionálni.
• Ultrahangosítás: Ezt a fehérjeextrakciós módszert leggyakrabban sejtszuszpenziók esetében alkalmazzák. A sejteket nagyfrekvenciás hanghullámokkal bontják meg a mintába helyezett szondán keresztül. A hanghullámok alacsony nyomású régiót hoznak létre, ami a sejtmembránok felbomlását okozza.
• Mechanikai módszerek: A sejtekből és szövetekből különböző durva, de hatékony "zúzás és őrlés" módszerekkel kivonhatók a fehérjék. Például a sejtmembránokat folyékony nyíróerőkkel fel lehet bontani Dounce vagy Potter-Elvehjem homogenizálással. A szövetek homogenizálhatók Waring turmixgép vagy Polytron® homogenizátor segítségével hűtött pufferben történő aprítással vagy darálással. A szövetek vagy sejtek folyékony nitrogénben lefagyaszthatók, és finom porrá őrölhetők timfölddel vagy homokkal ellátott mozsárral és pisztollyal. A sejtek gyors keverése finom üveggyöngyökkel megbontja a sejtfalakat, hatékony a legtöbb Gram-pozitív és Gram-negatív baktérium esetében.
• Enzimes emésztés: Enzimatikus emésztés: Az enzimatikus módszereket gyakran használják, amikor fehérjéket vonnak ki baktériumokból, élesztőből vagy olyan eukarióta sejtekből, amelyek rostos szövetekbe ágyazódtak, ahol a sejtmembránokat robusztus védőszerkezet veszi körül. Az olyan sejtlízis enzimek vagy koktélok, mint a lizozim, a mutanolizin, a metapolizim, a lizonáz és a pronáz szövetemésztő enzimekkel (pl. kollagenáz, kondroitináz, hialoronidáz) kombinálva használhatók a sejtfalak, burkok, kapszulák, kapszidok vagy más, mechanikus módszerekkel önmagában nem könnyen nyírható struktúrák feloldására vagy megbontására. Az enzimatikus emésztést homogenizálás, szonikálás vagy erőteljes vortexelés követheti lízispufferben.

Amellett, mivel endogén proteázok és foszfatázok szabadulhatnak fel a sejtek felbontásakor, és lebonthatják a célmolekulát, a mintát védeni kell a sejtek felbontása és az azt követő tisztítás során proteáz- és foszfatáz-inhibitorok segítségével a célpont ellenőrizetlen elvesztésének elkerülése érdekében.