Foszfatáz inhibitor koktél

Ian Gleiser, Pnina Yaish, Efrat Barnea-Gedalyahu, Dorit Zharhary

Bevezetés

A foszforiláció egy reverzibilis fehérje poszt-transzlációs módosítás. A fehérje kinázok katalizálják az ATP negatív töltésű γ-foszfátcsoportjának átvitelét a fehérje szerin-, treonin- vagy tirozin-maradványainak hidroxil-oldalláncára, megváltoztatva a fehérje konformációját és aktivitását. A fordított reakciót, a foszfát eltávolítását a fehérjéből, vagyis a defoszforilációt a fehérjefoszfatázok végzik.^1,2 Az emlősfehérjék három-négy százaléka kináz és foszfatáz, egyesek néhány célfehérjére specifikusak, míg mások széles körben, sok fehérjére hatnak. 

A fehérjék foszforilációja kulcsfontosságú szabályozási mechanizmus, amely szabályozza a fehérjék aktivitását, kölcsönhatásait, lokalizációját és degradációját. Szabályozza a jelátvitel, a sejtciklus, az apoptózis, az anyagcsere és más folyamatokat. Egy tipikus emlőssejtben található fehérjék körülbelül egyharmada foszforilálódik, sok közülük több helyen is. A szerin-foszforiláció a foszfoproteom 86%-át teszi ki, míg a treonin- és tirozin-foszforiláció 12%-ot, illetve 2%-ot. Számos emberi betegség a sejtfehérjék abnormális foszforilációjával hozható összefüggésbe.^3-5

A sejt számára számos előnnyel jár, ha egy fehérje foszforilációját/defoszforilációját kontrollmechanizmusként használja. Gyors, nem igényel új fehérjék szintézisét vagy a fehérjék lebomlását, és reverzibilis reakció.

A fehérje-foszforilációval járó sejtfolyamatok, például a jelátviteli kaszkádok és a fehérje-fehérje kölcsönhatások tanulmányozásakor, vagy egy fehérje foszforilált helyeinek elemzése és foszfoprotein-tisztításakor elengedhetetlen a sejtfehérje-foszfatázok foszfatáz-inhibitorokkal történő gátlása. Ez lehetővé teszi a célfehérje/fehérjék foszforilációs állapotának befagyasztását egy választott időpontban. A www.phosphosite.org foszforilációs adatbázis 80 000 foszforilációs helyet jelent. Ezek többségének kimutatása nem lenne lehetséges a foszfatáz inhibitorok használata nélkül.

Fehérje-foszfatázok

A fehérje-foszfatázokat szubsztrátspecificitásuk alapján alkategóriákra osztják (1. táblázat).

1. Alkalikus foszfatáz^6-8  - A nem specifikus foszfatázok családja, amely a foszfátcsoportok eltávolításáért felelős sokféle molekuláról, beleértve a fehérjéket, nukleotidokat és alkaloidokat. Az emlősök alkalikus foszfatáz izoenzimeit a homoarginin és a levamisol analógok gátolják. Az intestinális és placentáris izoenzimeket azonban nem gátolja a levamisol, de az imidazol gátolja.
2. Protein szerin/ treonin foszfatáz^9,10 - A foszfoprotein foszfatázok ezen osztálya teszi ki a Ser/Thr foszfatáz aktivitás többségét in vivo. Két fő alosztályt foglal magában, a PP1-et és a PP2-t. Ez utóbbit tovább osztják a fémionigény alapján: PP2A, amely nem igényel fémiont; PP2B, amely kalcium stimulált; és PP2C, amely Mg²⁺ függő. A Ser/Thr-foszfatázokat számos kis molekula gátolja, többek között tengeri szivacsokból, talajban élő streptomiciumokból. A legismertebbek az okadaic-sav, a calyculin A, a microcystin-LR, a tautomicin, a fostriecin és a kantaridin. E vegyületek aktivitása különböző specifitású a különböző Ser/Thr foszfatázokkal szemben.¹¹
3. Protein tirozin foszfatáz¹² - Az enzimek egy csoportja, amely a fehérjék foszforilált tirozinmaradványairól egy ciszteinil-foszfát enzimintermedier segítségével távolítja el a foszfátcsoportokat. Ezek az enzimek a jelátviteli útvonalak kulcsfontosságú szabályozó komponensei. A tirozin-foszfatázokat ortovanadát és rokon vegyületek, valamint nátrium-fluorid gátolja.
4. Dupla-specifitású (Tyr és Ser/Thr) foszfatázok³ - A kettős-specifitású foszfatázok a fehérje-tirozin-foszfatázok egy alosztálya, amelyek képesek a szerin- és treonin-maradékok foszforilálására is. Részt vesznek a kulcsfontosságú sejtszignál-útvonalak szabályozásában. Konkrét példák ezekre az inhibitorokra a hivatkozásban találhatók.¹³

1. táblázat Az állati szövetekben és sejtkultúrákban jelen lévő foszfatázok típusai. Hivatkozás: (14,15,16,17,18,19)

Foszfatáz	pHspectrum	Inhibitorok
Alkalikus foszfatázok6-8	8-11	Bromotetramisol14levamisol,vanadát15 imidazloe16
Ser/Thr foszfatázok9-10 (i.e.,PP28és PP2C)	7-8	Okadaic acid17 Mikro-cisztin LR Cantharidin, lnhibitor-2	7-8	Okadaic sav17/td>
Ser/Thr foszfatázok9-10 - Ionfüggő (i.e.,PP2Bés PP2C)	7-8	EDTA,Okadaic sav, ciklosporinF,K-50618
Tirozin kettős specificitás12	7-8	Vanadát18 peroxován-dium vegyületek19
Dupla specificitású foszfatázok		Vanadát18

Foszfatáz inhibitor koktélok

A foszfatáz inhibitorok használata kritikus fontosságú a foszforilációs vizsgálatok minden típusánál. A fehérjék defoszforilációtól való védelmének biztosítása érdekében a foszfatázok legszélesebb körét lefedő foszfatáz inhibitor koktélok sorát kínáljuk. A termékcsalád 2 koktélt tartalmaz: Foszfatáz inhibitor koktél 2 (Cat. No. P5726) és a foszfatáz inhibitor koktél 3 (Cat. No. P0044). A Phosphatase Inhibitor Cocktail 3, a legújabb foszfatáz inhibitor koktélunk a Ser/Thr foszfatázok felé irányuló foszfatáz inhibitorok keveréke. A foszfatáz inhibitor koktél 3 a foszfatáz inhibitor koktél 1 (Cat. No. P2850). A két koktél közötti különbség az, hogy az új Foszfatáz inhibitor koktél 3 a Foszfatáz inhibitor koktél 1-ben található mikrocisztin-LR helyett Calyculin A-t tartalmaz. A 2. táblázat tartalmazza az egyes koktélokban található inhibitorok listáját.

2. táblázat Foszfatáz inhibitor koktél összetevői

Foszfatáz inhibitor koktél 1 Cat No. P2850	Foszfatáz inhibitor koktél 2 Kat.sz. P5726	Foszfatáz inhibitor koktél 3 sz. P0044
Kantaridin (-)-p-8romotetram lsole Microcystin LR	Nátrium-ortovanadát Nátrium-olibdát Nátrium-tartarát lmidazol	Kantaridin (-)-p-brómtetram izol Kalikulin A

Kísérleti eredmények

A következő kísérleti adatok az új foszfatáz inhibitor koktél 3 és az általa helyettesített foszfatáz inhibitor koktél 1 (Cat. No. P2850) gátló hatását hasonlítják össze. Az adatok azt mutatják, hogy a két koktél aktivitása egyenértékű.

Az adatokból kiderül, hogy a foszfatázok széles körének gátlása és a teljes foszfatázaktivitás hatékony csökkentése érdekében ajánlott mindkét foszfatázgátló koktélunk, a 2. foszfatázgátló koktél (Cat. No. P5726) és a Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 (Cat. No. P0044).

A PP1α-szerű endogén aktivitást különböző sejt- és szövetkivonatokban a 32P-Ser foszforiláz A radioaktív szubsztrát segítségével mértük pH 7,5, 30 °C-on. A PP1α-szerű aktivitás mérése előtt 5 perccel, 30 °C-on 1%-os végső koncentrációban foszfatáz inhibitor koktélt 1 (Cat. No. P2850) vagy foszfatáz inhibitor koktélt 3 (Cat. No. P0044) adtunk a kivonatokhoz. A 1. ábra -ban feltüntetett aktivitások relatívak és nem abszolútak. Minél kisebb a megmaradt aktivitás, annál nagyobb a reakcióba adott koktél által okozott gátlás mértéke.

* Az ezeknél a mintáknál megfigyelt érték túl alacsony ahhoz, hogy a diagramon látható legyen, és nagyon közel van a nullához.

1. ábra. A PP1α-szerű aktivitás gátlása sejt- és szövetkivonatokban

A fehérje-foszfatáz 1α-szerű aktivitás gátlása

Foszfatáz inhibitor koktél 3 (Cat. No. P0044) a fehérje-foszfatáz 1α-szerű aktivitás hatékony gátlója sejtekben és szövetekben. Az alábbi kísérletek a gátlás hatékonyságát mutatják be, és összehasonlítják a korábbi Phosphatase Inhibitor Cocktail 1 (Cat. No. P2850).

Az emberi placenta 10-20-szor nagyobb PP1α-szerű aktivitást mutat mg fehérjénként, mint más szövetkivonatok. Ezért ezt választottuk a foszfatáz inhibitor koktélok gátlási hatékonyságának bizonyítására.

A humán placenta kivonatban az endogén PP1α-szerű aktivitást a radioaktív szubsztrát P-Ser foszforiláz A segítségével mértük pH 7,5, 30 °C-on. Különböző mennyiségű foszfatáz inhibitor koktél 1 (Cat. No. P2850) vagy foszfatáz inhibitor koktél 3 (Cat. No. P0044) adtuk a kivonathoz 30 °C-on, 5 perccel a PP1α-szerű aktivitás vizsgálata előtt.

A szarvasmarha-májkivonatban az endogén AP-szerű aktivitást pNPP-t használva szubsztrátként, pH 10,4, 37 °C-on kolorimetriás próbával mértük. A gátlást úgy végeztük el, hogy a kivonatot foszfatáz inhibitor koktél 3-mal (Cat. No. P0044) önmagában vagy a 2. foszfatáz inhibitor koktéllal együtt (Cat. No. P5726) 3 percig 37 °C-on az AP-szerű aktivitás vizsgálata előtt.

Az alkalikus foszfatáz (AP) hasonló aktivitás gátlása

Amint fentebb említettük, a különböző alkalikus foszfatáz izoenzimeket különböző inhibitorok gátolják. A foszfatáz inhibitor koktél 3 (Cat. No. P0044) erősen gátolja az alkalikus foszfatáz L-izoformáit, amelyek a szarvasmarha-májból származó kivonatokban jelen vannak, és szinergista hatást mutat, ha a 2. foszfatáz inhibitor koktéllal (Cat. No. P5726) ( 3A ábra).

A foszfatáz inhibitor koktél 3 (Cat. No. P0044) kevés hatással van az alkalikus foszfatáz aktivitás P-izoformáinak gátlására, amelyek bőségesen előfordulnak a humán placenta kivonatokban, ezért a gátlás a foszfatáz inhibitor koktél 2 (Cat. No. P5726 (3B ábra).

3A. és B. ábra. Az alkalikus foszfatáz (AP) típusú aktivitás dózisfüggő gátlása szarvasmarha-májkivonatban

1. Johnson L. 2009. The regulation of protein phosphorylation. 37(4):627-641. https://doi.org/10.1042/bst0370627

2. Moorhead G, De Wever V, Templeton G, Kerk D. 2009. Evolution of protein phosphatases in plants and animals. 417(2):401-409. https://doi.org/10.1042/bj20081986

3. I S, L S, E N. 2006. Protein kinases, their function and implication in cancer and other diseases. Folia Biol (Praha). 52(3):81-100.

4. Olsen JV, Blagoev B, Gnad F, Macek B, Kumar C, Mortensen P, Mann M. 2006. Global, In Vivo, and Site-Specific Phosphorylation Dynamics in Signaling Networks. Cell. 127(3):635-648. https://doi.org/10.1016/j.cell.2006.09.026

5. Graves JD, Krebs EG. 1999. Protein Phosphorylation and Signal Transduction. Pharmacology & Therapeutics. 82(2-3):111-121. https://doi.org/10.1016/s0163-7258(98)00056-4

6. Moss DW. 1992. Perspectives in Alkaline Phosphatase Research. 38(12):2486-2492. https://doi.org/10.1093/clinchem/38.12.2486

7. Onsgard-Meyer M, McCoy AL, Knox FG. 1996. Effect of Bromotetramisole on Renal Phosphate Excretion. Experimental Biology and Medicine. 213(2):193-195. https://doi.org/10.3181/00379727-213-44050

8. Crofton PM. 1982. Biochemistry of Alkaline Phosphatase Isoenzymes. CRC Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 16(3):161-194. https://doi.org/10.3109/10408368209107027

9. Barford D. 1996. Molecular mechanisms of theprotein serine/threonine phosphatases. Trends in Biochemical Sciences. 21(11):407-412. https://doi.org/10.1016/s0968-0004(96)10060-8

10. Wera S, Hemmings BA. 1995. Serine/threonine protein phosphatases. 311(1):17-29. https://doi.org/10.1042/bj3110017

11. Swingle M, Ni L, Honkanen RE. Small-Molecule Inhibitors of Ser/Thr Protein Phosphatases: Specificity, Use and Common Forms of Abuse.23-38. https://doi.org/10.1385/1-59745-267-x:23

12. Wang W, Sun J, Zhang Z. 2003. An Overview of the Protein Tyrosine Phosphatase Superfamily. CTMC. 3(7):739-748. https://doi.org/10.2174/1568026033452302

13. Pestell KE, Ducruet AP, Wipf P, Lazo JS. 2000. Small molecule inhibitors of dual specificity protein phosphatases. Oncogene. 19(56):6607-6612. https://doi.org/10.1038/sj.onc.1204084

14. Van Belle H, De Broe ME, Wieme RJ. 1977. L-p-Bromotetramisole, a new reagent for use in measuring placental or intestinal isoenzymes of alkaline phosphatase in human serum.. 23(3):454-459. https://doi.org/10.1093/clinchem/23.3.454

15. CHAKRABARTTY A, STINSON R. 1985. Properties of membrane-bound and solubilized forms of alkaline phosphatase from human liver. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 839(2):174-180. https://doi.org/10.1016/0304-4165(85)90034-0

16. Brunel C, Cathala G. 1972. Imidazole: An inhibitor of l-phenylalanine-insensitive alkaline phosphatases of tissues other than intestine and placenta. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 268(2):415-421. https://doi.org/10.1016/0005-2744(72)90337-3

17. Takai A, Mieskes G. 1991. Inhibitory effect of okadaic acid on the p-nitrophenyl phosphate phosphatase activity of protein phosphatases. 275(1):233-239. https://doi.org/10.1042/bj2750233

18. Lum H, Podolski JL, Gurnack ME, Schulz IT, Huang F, Holian O. 2001. Protein phosphatase 2B inhibitor potentiates endothelial PKC activity and barrier dysfunction. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 281(3):L546-L555. https://doi.org/10.1152/ajplung.2001.281.3.l546

19. B I P, R F, J W B, A P B, D L, G Z, I G F, J B N, D A H, B S L. 1994. Peroxovanadium compounds. A new class of potent. hosphotyrosine phosphatase inhibitors which are insulin mimetics J Biol Chem. 269(6):4596-604.

20. Cohen P, Alemany S, Therese BA, Resink J, Stralfors P, Lim Tung H. 1988. [37] Protein phosphatase-1 and protein phosphatase-2A from rabbit skeletal muscle.390-408. https://doi.org/10.1016/0076-6879(88)59039-0