Standard fordított átírási protokoll

Reverz transzkripció

A reverz transzkripció (RT) az RNS cDNS-é történő átalakítása egy reverz transzkriptáz enzim és dNTP-k segítségével.

Az RT lépés elvégezhető teljes RNS-en úgy, hogy a mintában lévő összes RNS-transzkriptumot reprezentáló globális cDNS készüljön (általában kétlépéses protokoll segítségével), vagy génspecifikus megközelítésben úgy, hogy csak az érdekes RNS-t alakítjuk át cDNS-vé (általában egylépéses protokollt követve).

A következő kísérletek alap RT protokollként használhatók, amelyek az egyedi igényeknek megfelelően módosíthatók. A cDNS-t vagy kétlépéses eljárással szokás előállítani, a cDNS-nek a PCR/qPCR-hez való hozzáadása előtti utólagos hígításával, vagy egylépéses reakciót kell készíteni, ahol mindkét folyamatot egymás után végzik el.

Készülékek

• Szokásos PCR-műszer vagy fűtőblokk
• Lamináris áramlású elszívó az RT beállításához (opcionális)

Reagensek

• RNS (törzsoldat kb. 1 μg/μL).
• ReadyScript^® kétlépéses cDNS-szintézis készlet (RDRT). Alternatív reverz transzkripciós kitek is használhatók oligo-dT primerekkel és/vagy random primerekkel együtt.
• PCR minőségű víz: PCR minőségű víz (W1754 vagy W4502) 20 ml-es aliquotként; fagyassza le; minden reakcióhoz használjon friss aliquotot.

Kellékek

• Szteril szűrő pipette-tips
• Steril 1.5 ml-es csavaros tetejű mikrocentrifugacsövek (CLS430909)
• PCR csövek és lemezek, válasszon egyet a kívánt formátumnak megfelelően:
  - Egyedi vékonyfalú 200 μL-es PCR-csövek (Z374873 vagy P3114)
  - Lemezek
    - 96 lyukú lemezek (Z374903)
  .br>   - 384 lyukú lemezek (Z374911)
  - Lemezzárók vagy kupakok
    - ThermalSeal RTS™ tömítőfóliák (Z734438)
   ThermalSeal RTS™ tömítőfóliák (Z734438)
    - ThermalSeal RT2RR™ fólia (Z722553)

Módszer

Előkészítés

1. Tegye a ReadyScript^® kit összetevőit és az RNS-mintákat jégre.
2. Keverje össze, majd rövid centrifugálással gyűjtse össze a tartalmát a cső alján.

Reakció

1. Határozza meg a szükséges reakciók számát, beleértve a kontrollokat is. Számítsa ki az összes reakcióhoz szükséges egyes komponensek térfogatát (a pipettázási hibákra 10% többletet hagyjon jóvá), és kombinálja a reagenseket a P10-26. táblázat szerint, 0,2 ml-es csövek vagy jégen álló 96 lyukú lemez segítségével. Ha PCR-lemezt használ, kövesse a lemez sémáját, hogy a reagenseket a megfelelő lyukakba adagolja.

P10-26. táblázat. ReadyScript^® cDNS-szintézisreakció mesterkeverék

Reagens		Térfogat (μL) egy egyszeri 20 μL-es reakcióhoz
ReadyScript®cDNS szintézis keverék (5× RT blend)	4
Teljes RNS sablon-változó (1 μg-tól 10 pg-ig)	1
PCR minőségű víz		15

2. Az egyes reakciók lezárása után óvatosan keverje össze a tartalmat. Rövid centrifugálással gyűjtse össze a komponenseket a reakciócső alján.
3. Inkubálja a reakcióelegyet a P10-27. táblázat szerint.

P10-27. táblázat. ReadyScript^® cDNS-szintézis reakcióhőmérséklet inkubációs profilja

Hőmérséklet (°C)	Idő (perc)
25	5
42	30
85		5
4	Hold

4. A cDNS-szintézis befejezése után az első szálas reakcióból 1:5-1:10 arányban (2-4 μL) használjon fel a PCR-amplifikációhoz.  
   Megjegyzés: ReadyScript^® reagensek használata esetén 2-4 μL hígítatlan cDNS adható a PCR-hez anélkül, hogy gátlást okozna. Ha szükséges, a cDNS termék 10 mM Tris- HCl (pH 8,0), 0,1 mM EDTA-val hígítható és -20 °C-on tárolható.