Bukkális DNS extrakció és WGA-amplifikációs protokoll

Ez a protokoll egyszerű és kényelmes módszert kínál genomi DNS izolálására, amplifikálására és tisztítására bukkális sejtmintából. A bukkális tamponok kényelmes módszer a DNS-minta megszerzésére. Miután a DNS-t a miniprep extrakciós protokoll segítségével izoláltuk, a DNS a teljes genom amplifikációs protokoll segítségével amplifikálható.

Genomi DNS miniprep protokoll

A legjobb eredmény érdekében használja a GenElute emlős genomi DNS miniprep kitet (G1N10) ehhez a folyamathoz.

1. Szárítsa az összegyűjtött tamponokat szobahőmérsékleten 15 percig.
2. Adjon hozzá 280 μL T lízisoldatot és 20 μL proteináz K-t. Helyezze be a tampont és óvatosan forgassa meg. Zárja le a csövet, és keverje el vortexeléssel.
3. Inkubálja a mintát 55 °C-on 20 percig, időnkénti vortexeléssel.
4. Adjon hozzá 200 μL C lízisoldatot, és 15 másodpercig alaposan vortexeljen.
5. Inkubáljuk 70 °C-on 10 percig.
6. Adjunk 500 μL oszlopkészítő oldatot minden GenElute Miniprep kötőoszlophoz (piros o-gyűrű), és centrifugáljuk 12 000 × g-n 1 percig. Dobja el az átfolyó folyadékot.
   Megjegyzés: Az oszlop-előkészítő oldat maximalizálja a DNS kötődését a membránhoz, ami egyenletesebb hozamot eredményez
7. Adjon 200 μL 95-100%-os etanolt az 5. lépésből származó lizátumhoz.
8. Keverje össze alaposan vortexeléssel, és adja a cső teljes tartalmát a kötőoszlopba.
9. Centrifugáljon ≥6500 × g-n 1 percig.
10. Dobja ki az átfolyást tartalmazó gyűjtőcsövet, és helyezze a kötőoszlopot egy új 2 ml-es gyűjtőcsőbe.
11. Adjon hozzá 500 μL mosóoldatot (az első használat előtt mindenképpen hígítsa etanollal), és centrifugáljon ≥6500 × g-n 1 percig.
12. Eldobja a gyűjtőcsövet és az átfolyást, és helyezze a kötőoszlopot egy új 2 mL-es gyűjtőcsőbe.
13. Adjon a kötőoszlophoz további 500 μL mosóoldatot, és a kötőoszlop szárításához centrifugálja maximális fordulatszámon (12 000-16 000 × g) 3 percig.
14. Pipettázzon 200 μL eluáló oldatot a kötőoszlopra, és centrifugálja 1 percig ≥6500 × g sebességgel.
15. Tárolja az eluált DNS-t -20 °C-on, vagy folytassa az amplifikációs lépést.
    Megjegyzés: Ha a WGA2 -t használja, nincs szükség DNS-polimerázra, mivel az enzimet a készlet tartalmazza
    

A teljes genom amplifikáció (WGA) protokollja

Protokoll a GenomePlex teljes genom-amplifikációhoz, amelyet a GenomePlex teljes genom-amplifikációs készlettel (WGA1) és/vagy a teljes teljes genom-amplifikációs készlettel (WGA2) végeznek.

Fragmentálás

1. Készítsen 1 ng/ml DNS-oldatot a fent leírt teljes vér extrakciós protokollból.
2. Adjon 1 µl 10X fragmentációs puffert 10 µl DNS-hez (1 ng/µl) egy PCR-csőben.
3. Tegye a csövet 95 °C-os hőciklálóba pontosan 4 percre. Vegye figyelembe, hogy az inkubáció időérzékeny, és bármilyen eltérés megváltoztathatja az eredményeket. 
4. A mintát azonnal hűtse le jégen, és rövid ideig centrifugálja.

Könyvtárkészítés

1. Adjon hozzá 2 µl 1x Könyvtárkészítő pufferből. 
2. Adjunk hozzá 1 µL könyvtárstabilizáló oldatot.
3. Alaposan keverjük össze, és tegyük a termikus ciklálóba 95 °C-on 2 percre.
4. Hűtsük a mintát jégen, és röviden centrifugáljuk.
5. Adjunk hozzá 1 µL könyvtárkészítő enzimet, alaposan keverjük össze, és röviden centrifugáljuk.
6. Tegye a mintát a termikus ciklálóba, és inkubálja az alábbiak szerint:
        16 °C 20 percig
        24 °C 20 percig
        37 °C 20 percig
        37 °C 20 percig
   br>      75 °C 5 percig
        4 °C-on tartás
7. Vegyük ki a mintákat a hőciklálóból, és rövid ideig centrifugáljuk. A minták azonnal amplifikálhatók vagy -20 °C-on három napig tárolhatók.
   

Amplifikáció

1. Adja hozzá a következő reagenseket a teljes 15 µl-es reakcióhoz:
        7.5 µL 10x Amplifikációs mesterkeverék
        47,5 µL nukleázmentes víz
        5,0 µL JumpStart Taq DNS-polimeráz (12.5 egység) a WGA1
        -vagy-
        5.0 µL WGA DNS-polimeráz a WGA2
2. Gyúrja össze alaposan, centrifugálja röviden, és kezdje meg a termociklizálást
br>
3. A ciklizálás befejezése után tartsa a reakciókat 4 °C-on, vagy tárolja -20 °C-on, amíg elemzésre vagy tisztításra készen nem áll.
   

Újraamplifikálás

1. Adjon 10 µl 1 ng/mL WGA-amplifikált DNS-t egy PCR-csőbe vagy több lyukú lemezbe.
   Megjegyzés: A WGA-reakciót meg kell tisztítani, hogy csökkentsük a reamplikáció esetleges torzítását. Javasoljuk a GenElute™ PCR Clean-Up Kit (termékszám NA1020) vagy az egy- és kétszálú DNS-t izoláló standard tisztítási módszerek használatát.
2. Hozzuk létre az amplifikációs keveréket. Minden egyes reamplikációs reakcióhoz adja hozzá a következőket a WGA amplifikált DNS-hez (1. lépés):
        47,5 µl nukleázmentes víz
        7.5 µL 10X Amplification Master Mix
        5 µL WGA DNS-polimeráz
3. Alaposan forgassa össze, centrifugálja rövid ideig, és kezdje meg a termociklizálást. A következő profilt a PE 9700 vagy azzal egyenértékű termociklálóra optimalizáltuk:
        Kezdeti denaturálás 95 °C-on 3 percig
        Végezzen 14 ciklust az alábbiak szerint:
           Denaturálás 94 °C-on 15 másodpercig
           Anneal/Extend 65 °C 5 percig
4. A ciklus befejezése után a reakciókat 4 °C-on tartsuk, vagy tároljuk -20 °C-on, amíg elemzésre vagy tisztításra készen nem állunk. A WGA DNS stabilitása megegyezik az azonos körülmények között tárolt genomi DNS-ével.
   

A bukkális kenetminták amplifikált tisztítása

A GenElute PCR Clean-Up Kit (NA1020)

1. Egy GenElute Miniprep kötőoszlopot (kék O-gyűrűvel) helyezzen a mellékelt gyűjtőcsőbe, ha még nem állt össze. Adjon 0,5 ml oszlop-előkészítő oldatot minden egyes miniprep oszlophoz, és centrifugálja 12 000 x g-n 30 másodperctől 1 percig. Dobja el az eluátumot.
   Megjegyzés: Az oszlop-előkészítő oldat maximalizálja a DNS kötődését a membránhoz, ami egyenletesebb hozamot eredményez.
2. Adjon 5 térfogat kötőoldatot a PCR-reakció 1 térfogatához, és keverje össze. Például adjon 500 µl kötőoldatot 100 µl PCR-reakcióhoz. Vigye át az oldatot a kötőoszlopba. Centrifugálja az oszlopot maximális fordulatszámon (12 000-16 000 x g) 1 percig. Dobja el az eluátumot, de tartsa meg a gyűjtőcsövet.
3. Tegye vissza a kötőoszlopot a gyűjtőcsőbe. Adjon 0,5 ml hígított mosóoldatot az oszlopra, és centrifugálja maximális fordulatszámon 1 percig. Dobja el az eluátumot, de tartsa meg a gyűjtőcsövet.
   Jegyzet: Első használat előtt mindenképpen adjon etanolt a mosóoldat-koncentrátumhoz. Lásd az előkészítési utasításokat.
4. Tegye vissza az oszlopot a gyűjtőcsőbe. Centrifugálja az oszlopot maximális fordulatszámon 2 percig, további mosóoldat nélkül, a felesleges etanol eltávolítása érdekében. Dobja el a maradék eluátumot, valamint a gyűjtőcsövet.
5. Tegye át az oszlopot egy friss 2 ml-es gyűjtőcsőbe. Adjon 50 µl eluáló oldatot vagy vizet minden oszlop közepére. Inkubálja szobahőmérsékleten 1 percig.
   Megjegyzés: Ha vízzel eluál, győződjön meg arról, hogy a víz pH-ja 5,5 és 8,5 között van. Az eluálás elvégezhető a 10-szeres vízzel hígított eluáló oldattal is.
6. A DNS eluálásához centrifugálja az oszlopot 1 percig maximális fordulatszámon. A PCR-amplifikációs termék már az eluátumban van, és azonnal felhasználható vagy -20 °C-on tárolható.
   

A bukkális kenetminták amplifikált mennyiségének meghatározása

A teljes genom-amplifikációval amplifikált DNS mennyisége tisztítással vagy anélkül is kimutatható. A legjobb minőségű DNS-mintákhoz erősen ajánlott a minták tisztítása az amplifikáció után. Az amplifikált termékek a Molecular Probes Inc. által gyártott PicoGreen^® dsDNS Quantitation Assay-vel (7589) mérhetők. Az amplifikált termékek kimutatásának másik módszere a spektrofotometriás abszorpció (OD260) NanoDrop^® spektrofotométeren. Ez a műszer 1 μL minta abszorbanciáját nagy dinamikai tartományban (2-3 700 ng/μL) tudja mérni.

Alkalmazási adatok a bukkális kenetminta-amplifikációhoz

A teljes genom-amplifikáció bukkális kenetmintán

Amplikált termékeket 1,5%-os agaróz gélen láthatóvá tettük. Az amplifikált termékből 5 µl-t töltöttünk be lyukanként. A GenomePlex amplifikált termékek átlagos mérete 400 bp. A gélen látható elkenődési mintázat forrásonként eltérő.

1. sáv - 1 kb létra
2. sáv - vér
3. sáv - növény
4. sáv - bukkális kenet
5. sáv - talaj
6. sáv - pozitív kontroll
7. sáv - 1 kb létra

Szükséges további anyagok

• Bukális kenet
• 1.5 ml-es mikrocentrifugacsövek
• Mikrocentrifuga (rotorral a 2 ml-es csövekhez)
• 55 °C-os vízfürdő vagy hőblokk