Oligonukleotidok izzítása Protokoll

• Abbreviations
• Dna / Rna izzító berendezések és kellékek
• Dna / Rna izzítási módszer
• Pufferreceptek Dna izzításhoz

Ez a protokoll két egyszálú, komplementer szekvenciájú oligonukleotid lágyítására szolgál (1. ábra). A hevítés és az azt követő hűtés megkönnyíti a hibridizációt.

1. ábra. Példa egy lágyítási reakcióra. A hő "megszakítja" az összes hidrogénkötést, ezáltal megbontva az egyes oligonukleotidok másodlagos szerkezetét. A lassú lehűlés ezután megkönnyíti a hibridizációt, mivel új hidrogénkötések alakulnak ki a komplementer szekvenciák között.

Definíciók / rövidítések

EDTA: Ethiléndiamintetraecetsav

NaCl: nátrium-klorid

Trizma^® bázis: A Tris [Tris(hidroximetil)aminometán]

Oligo: Az oligonukleotid vagy oligomer rövidítése. Az oligonukleotidok rövid, egyszálú DNS- vagy RNS-molekulák, amelyeket lágyítani kell (felmelegíteni vagy megolvasztani), hogy összekapcsolódhassanak és egy megfelelő komplementer DNS- vagy RNS-szállal kettős szálat alkossanak.

DNS-lágyítás: Ez az oldal az összes oligonukleotid lágyítási folyamatát tárgyalja. Néha a lágyítást DNS-lágyításként említik, annak ellenére, hogy a folyamatot RNS esetében is alkalmazzák. Az izzítás két egyszálú, komplementer szekvenciájú oligonukleotid melegítésének és hűtésének folyamata. A hő megszakítja az összes hidrogénkötést, a hűtés pedig lehetővé teszi, hogy új kötések alakuljanak ki a szekvenciák között.

DNS / RNS lágyító berendezések és kellékek

• Hőblokk vagy termocikcler
• 2 ml-es centrifugacsövek
• Pipettahegyek
• Milli-Q^® H₂O
• EDTA (termékszám. E9884)
• NaCl (termékszám. S3014)
• Trizma^® base (Termék sz. 93362)
• Két egyszálú oligonukleotid komplementer szekvenciákkal

DNS / RNS lágyítási módszer

A lágyítási folyamat két fő lépésre oszlik: 1) feloldás és 2) lágyítás, akár hőblokkolással, akár termociklón.

Oligo feloldás

Bár minden oligonukleotid kimért mennyiségben érkezik, a legjobb eredmény érdekében ellenőrizze spektrofotométerrel, hogy minden oligonukleotidból azonos mennyiséget adjon a reakcióhoz.

• Olvasson fel minden oligonukleotidot egy térfogatnyi izzító pufferben (lásd az alábbi pufferrecepteket) úgy, hogy mindegyiknek azonos legyen a koncentrációja.
• Az egyes oligonukleotidok koncentrációjának a duplex oligonukleotid kívánt koncentrációjának 2-szeresének kell lennie.

Példa

A duplex oligonukleotid kívánt koncentrációja 50 µM.

1. Oligonukleotid 1: 10,55 OD-vel szállítva (312.6 µg, 49,9 nmol); ellenőrizze a mért OD mennyiséget spektrofotométerrel.
2. Oligonukleotid 2: 9,04 OD-vel szállítják (279,7 µg, 45,9 nmol); ellenőrizze a mért OD mennyiséget spektrofotométerrel.
3. Minden oligonukleotid törzsoldatnak a kívánt duplex oligonukleotid-koncentráció 2-szeresének kell lennie, azaz mindegyik törzsoldatnak 100 µM-nek kell lennie.
   1. Az oligonukleotid 1 esetében adjunk hozzá 49.9 x 10 = 499 µL Annealing Puffer-t a 100 µM-os törzsoldat létrehozásához.
   2. A 2. oligonukleotidhoz adjon 45,9 x 10 = 459 µL Annealing Puffer-t a 100 µM-os törzsoldat létrehozásához.

*Ez a számítás egy rövidítés, amely csak 100 µM-os oldatok létrehozásához működik, és itt csak példaként szolgál. A különböző oligonukleotid-koncentrációk kiszámításával kapcsolatos további információkért lásd Kezelési útmutató és stabilitás.

Oligo lágyítás

Hőblokkolás

1. Keverjen össze egyenlő térfogatú, ekvimoláris oligonukleotidokat egy mikrocsőben.
2. Inkubálja a mikrocsövet 95 °C-on 5 percig.
3. A mikrocsövet hagyja lassan szobahőmérsékletre hűlni (<60 perc).

Thermocikláló

Bár egy hőblokk is működik, a termociklálóval következetesebb folyamatot lehet elérni.

1. Egy PCR-csőben keverje össze az ekvimoláris oligonukleotidok egyenlő térfogatait.
2. A következő termikus profilt használja:
   1. Fűtse 95 °C-ra, és tartsa a hőmérsékletet 2 percig.
      
   2. Hűtse le 25 °C-ra 45 perc alatt.
      
   3. Hűtse le 4 °C-ra az ideiglenes tároláshoz.
3. Centrifugálja a PCR-csövet röviden, hogy a fedeléből minden nedvességet elszívjon.

A hőblokk vagy a termocikláló bevetését követően a duplex oligonukleotid most már felhasználható vagy tárolható. Az oligonukleotidok tárolásával kapcsolatos további tudnivalókért lásd Kezelési útmutató és stabilitás.

Pufferreceptek a DNS izzításához

Minden puffert Milli-Q^® vízzel készítsen.

Annealing puffer összetétele (1X)

• 10 mM Tris, pH 7,5 - 8.0
• 50 mM NaCl
• 1 mM EDTA

Ligáz puffer összetétele (1X)

Ezt a puffert általában a T4 DNS-ligázzal együtt használják.

• 50 mM Tris-HCl, pH 7.5
• 10 mM MgCl₂
• 1 mM ATP
• 10 mM DTT

Kináz puffer összetétele (1X)

Ezt a puffert általában a T4 polinukleotid kinázzal együtt használják.

• 70 mM Tris-HCl, pH 7,6
• 10 mM MgCl₂
• 5 mM DTT