Tween-tartalmú IgG-formulák méret-kizárási elemzése

A tisztítás során és a végső formulában a fehérjék, beleértve a monoklonális antitesteket és más bioterápiás szereket, gyakran alacsony koncentrációjú felületaktív anyag (<0,01%) jelenlétében vannak, hogy gátolják a fehérjék aggregációját vagy adszorpcióját^1-3. A nagy teljesítményű szilícium-dioxid alapú gélszűrő oszlopok, mint például az 5 mikronos töltésű SRT^® SEC-300 oszlopok lehetővé teszik a Tween^® 20 vagy Tween 80 felületaktív anyagok hatásának pontos értékelését a fehérje hatóanyag-készítmények aggregációs szintjére.

A poliszorbátok 20 és 80, amelyek Tween 20 és Tween 80 néven kereskedelmi forgalomban vannak, a legnépszerűbb nem ionos felületaktív anyagok közé tartoznak, amelyeket az aggregátumképződés korlátozására használnak bioterápiás oldatokban. Mivel az aggregátumok jelenléte a fehérje hatóanyag-készítményekben immunológiai választ eredményezhet, a gyártóknak meg kell határozniuk az aggregáció mértékét az ilyen készítményekben. A méretkizárásos kromatográfia elfogadott módszer a bioterápiás készítményekben lévő aggregáció mértékének meghatározására. Mivel a SEC mobilfázis összetétele eltér a készítmény összetételétől, fontos annak meghatározása, hogy a mobilfázis körülményei, amelyek mellett a bioterápiás szer eluálódik az oszlopról, nem befolyásolják a készítményben jelen lévő aggregáció mértékét. A fehérjeaggregátumok gyakran képeznek irreverzibilis oldható aggregátumokat, amelyeket a mobilfázis összetétele nem befolyásol, bár sok folyamat közbeni aggregátum nem képződik irreverzibilisen³. Egy ilyen vizsgálat részeként fontos meghatározni a felületaktív anyag hozzáadásának hatását is a mintához, hogy megbizonyosodjunk arról, hogy a fehérje és az aggregátumok eluálásának időpontjában a felületaktív anyag koncentrációja hasonló a készítményben lévő felületaktív anyag koncentrációjához. Ebben a tanulmányban egy saját fejlesztésű monoklonális antitest (mAb 221) elúciós pozícióinak Tween 20 és Tween 80 hozzáadásának hatását vizsgáltuk SEC körülmények között.

Megbeszélés

Egy 30 cm × 4,6 mm I.D. méretű oszlopot használtunk, amely 300 Å pórusméretű, 5 mikronos szilikarészecskékkel volt megtöltve, amelyeket hidrofil funkciós csoporttal kötöttünk.Az 1. ábra mutatja a víz, 0,1% Tween 20, mAb 221 és a mAb 221-hez hozzáadott 0,1% Tween 20 egymást követő injektálásainak UV-nyomát. A 221-es monoklonális antitest nagy koncentrációjú mintájának kromatogramját kibővítettük, hogy jól látható legyen a fő komponens előtti kis aggregátumcsúcs. A Tween 20 hozzáadása a mintához nem volt mérhető hatással az aggregátum szintjére. Megjegyzendő, hogy a főkomponens hátulján lévő zavaró fragmentum természetét nem állapítottuk meg. Ugyanezt az SRT SEC-300 oszlopot használva a Tween 80 hatását is megvizsgáltuk a mAb 221 alacsonyabb koncentrációjú tételénél; lásd 2. ábra. Ez a minta egy kisebb aggregátumcsúcsot és egy további csúcsot mutatott a fő komponens után, míg a monoklonális antitestet zavaró fragmentumcsúcsra legfeljebb csak enyhe utalást lehetett találni. Ebben az esetben azt találtuk, hogy a Tween 80 hozzáadása az antitestmintához megváltoztatta az aggregátumprofilt, míg a 9,72 percnél eluálódó nagy ismeretlen csúcs mérete jelentősen csökkent.

1. ábra. Nincs interferencia a Tween 20-tól a mAb 221 SEC-ben

Feltételek

Oszlop: SRT SEC-300, 5 µm, 300 Å, 4,6 × 30 cm (termékszám. Z777049); mozgó fázis: 150 mM nátrium-foszfát puffer, pH 7,0; áramlási sebesség: 0.35 ml/perc; hőmérséklet: környezeti hőmérséklet; nyomás: 800 psi; det.: UV@214 nm; minta: mAb 221 #1; inj.: 3 µL

2. ábra. A Tween 80 hatása a mAb 221 SEC analízisére méretkizárásos kromatográfiával

Feltételek

Oszlop: SRT SEC-300, 5 µm, 300 Å, 4.6 × 30 cm (termékszám  Z777049); mozgó fázis: 150 mM nátrium-foszfát puffer, pH 7.0; áramlási sebesség: 0,35 ml/perc; hőmérséklet: környezeti hőmérséklet; nyomás: 800 psi; det.: UV@214 nm; inj.: 3 µL

Hivatkozások

1. Bondos SE, Bicknell A. 2003. Detection and prevention of protein aggregation before, during, and after purification. Analytical Biochemistry. 316(2):223-231. https://doi.org/10.1016/s0003-2697(03)00059-9

2. Kerwin BA. 2008. Polysorbates 20 and 80 Used in the Formulation of Protein Biotherapeutics: Structure and Degradation Pathways. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97(8):2924-2935. https://doi.org/10.1002/jps.21190

3. Narhi LO, Jiang Y, Deshpande R, Kang S, Shultz J. Approaches to Control Protein Aggregation during Bulk Production.257-299. https://doi.org/10.1002/9780470769829.ch6